F第十七章神经递质与其他生物活性物质的测定神经递质是神经系统进行信息传递过程的媒介物，是化学传递的物质基础。它们含量的高低常与一些神经、精神疾病密切相关。目前已知的神经递质约几十种，由于它们分子量小(般在200以下)，所在位置特殊，含量极低(多为ng)，因而一般的检测方法较难测定其含量测定神经递质的方法有灵敏高和特异性强的荧光分光光度法、气相色谱质谱法、高效液相色谱法、放射免疫法、酶联免疫法等，其中放射免疫法为临床常规测定方法。本章介绍血清(浆)B-内啡肽、P物质、-氨基丁酸、NO含量的测定。实验123放射免疫法测定β-内啡肽内啡肽(endorphin，EP)是1976年从脑组织分离出的一种吗啡样物质，目前在胃肠道也发现它的存在。在垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)的细胞中存在 β-EP的前体阿片促皮素在应激时可分解成ACTH(39肽)和β-脂肪释放激素(βB-LPH，91肽)，后者可进一步分解成β-EP(31肽)。α-EP(16肽)，-EP(17肽)，8-EP(19肽)均为β-EP的C-末端水解的片段。β-EP的N端五肽，即脑啡肽，是具有吗啡样活性的最短肽链。不同种属的β-EP的肽链在第23、27、31位残基上有差别。B-EP主要在小肠发现。【原理】放射免疫法测定β-EP的原理同一般放射免疫分析法相同，一是标记抗原β-EP，二是制备抗血清、三是分离标记抗原-抗体复合物(B)与游离标记抗原(F)。氯胺T法标记β-EP的原理：氯胺T为强氧化剂，能使放射性Nal25I溶液中的阴离子1251氧化成活泼的碘(很可能为I+),这活性碘可取代肽链上的酪氨酸苯环上中的羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。β-EP属半抗原，必须与蛋白质类载体结合才能形成理想的免疫原，本实验以牛甲状腺球蛋白(TG)作为载体，利用偶联剂碳二亚胺把β-EP与TG连接起来合成免疫原，并以此免疫家兔，获得特异性的β-EP抗血清。本实验的放射免疫分析法采用顺序饱和加样法，即先加标准物β-EP或待测血浆样品与抗血清混匀，进行一定时间(12～24h)的免疫反应。然后再加入标记抗原1251β-EP，与抗体反应，反应24h，最后以活性炭分离B与F，用计数仪测定沉淀物F的cpm，B的计数即T-F-NSB，计算标准管与样品管结合率B/Bo%，根据校正曲线和待测血浆样品的结合率B/Bo%，即可求得血浆中β-EP的含量【试剂】
1 第十七章 神经递质与其他生物活性物质的测定 神经递质是神经系统进行信息传递过程的媒介物，是化学传递的物质基础。它们含量的 高低常与一些神经、精神疾病密切相关。目前已知的神经递质约几十种，由于它们分子量小(一 般在 200 以下)，所在位置特殊，含量极低(多为 ng)，因而一般的检测方法较难测定其含量。 测定神经递质的方法有灵敏高和特异性强的荧光分光光度法、气相色谱质谱法、高效液相色 谱法、放射免疫法、酶联免疫法等，其中放射免疫法为临床常规测定方法。 本章介绍血清(浆)β-内啡肽、P 物质、γ-氨基丁酸、NO 含量的测定。 实验 123 放射免疫法测定β-内啡肽 内啡肽(endorphin，EP)是 1976 年从脑组织分离出的一种吗啡样物质，目前在胃肠道也发 现它的存在。在垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)的细胞中存在 β-EP 的前体阿片促皮素， 在应激时可分解成 ACTH(39 肽)和 β-脂肪释放激素(β-LPH，91 肽)，后者可进一步分解成 β-EP(31 肽)。α-EP(16 肽)，γ-EP(17 肽)，δ-EP(19 肽)均为 β-EP 的 C-末端水解的片段。β-EP 的 N 端五肽，即脑啡肽，是具有吗啡样活性的最短肽链。不同种属的 β-EP 的肽链在第 23、 27、31 位残基上有差别。β-EP 主要在小肠发现。 【原理】 放射免疫法测定β-EP的原理同一般放射免疫分析法相同，一是标记抗原β-EP， 二是制备抗血清、三是分离标记抗原-抗体复合物(B)与游离标记抗原(F)。 氯胺 T 法标记 β-EP 的原理：氯胺 T 为强氧化剂，能使放射性 Na 125I 溶液中的阴离子 125I 氧化成活泼的碘(很可能为 I + )，这活性碘可取代肽链上的酪氨酸苯环上中的羟基位的一个或两 个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。 β-EP 属半抗原，必须与蛋白质类载体结合才能形成理想的免疫原，本实验以牛甲状腺球 蛋白(TG)作为载体，利用偶联剂碳二亚胺把 β-EP 与 TG 连接起来合成免疫原，并以此免疫家 兔，获得特异性的 β-EP 抗血清。 本实验的放射免疫分析法采用顺序饱和加样法，即先加标准物 β-EP 或待测血浆样品与 抗血清混匀，进行一定时间(12～24h)的免疫反应。然后再加入标记抗原 125I β-EP，与抗体反 应，反应 24h，最后以活性炭分离 B 与 F，用γ计数仪测定沉淀物 F 的 cpm，B 的计数即 T －F－NSB，计算标准管与样品管结合率 B/B0 %，根据校正曲线和待测血浆样品的结合率 B/B0 %，即可求得血浆中 β-EP 的含量。 【试剂】
1.β-EP标准品，分子量为1745。2.0.5mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)3.Nal25I溶液。4.0.2%氯胺T溶液，用0.05mmol/LPBS(pH7.5)现配。5.0.2%偏亚硫酸钠溶液，用0.05mmol/LPBS(pH7.5)配制。6.0.1mol/L醋酸溶液。7.甲状腺球蛋白(TG)。8.碳二亚胺。9.福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。10．百日咳疫苗。11.PELH缓冲液[0.1mol/LPBS(pH7.5)，含3mmol/LEDTA-Na2，0.002%洗必泰，0.1%溶菌酶)，β-EP标准品、抗血清和1251-B-EP的稀释均用此缓冲液。12.抑肽酶用生理盐水溶解，使之每20u1含500KIU，用于1ml全血13.2%加膜活性炭溶液取活性炭2g，葡聚糖T700.2g，加入0.1mol/LPBS(pH7.5)至100ml，电磁搅拌1h，然后置于4℃备用。【操作步骤】1. 1251-β-EP标记(）标记：将β-EP3ug溶解于30u1的0.5mol/LPBS(pH7.5)中，加Nal2512.9X107Bq混匀后加新鲜配制的0.2%氯胺T溶液15u1，迅速振荡混匀，在室温下反应75s，加入还原剂0.2%偏亚硫酸钠溶液40u1终止碘化反应。(2）分离：将标记反应混合物注入Bio-GelP2层析柱(0.75cm×25cm)，用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，每min收集一管，每管约350ul，共收集60管，测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一个峰为1251-β-EP，第二个峰为受损伤的抗原峰，第三个峰为游离的Na1251峰(3）标记抗原的检查：免疫化学活性的检查，以少量标记抗原与过量抗体反应，然后用适当的方法分离B与F，分别测定其放射性，观察其最大结合率，制备良好的标记抗原，其最大结合率往往超过90%，如最大结合率低于70%，则此标记抗原不能使用。若经检查，受损伤的抗原较多，应用适当的方法将之分离除去。此外游离碘(未与抗原结合的游离放射性碘)应小于5%。(4）贮存：合并第一个峰中计数最高的几管，测其比放射性，加入1/8体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐一20℃贮存可使用2个月，避免反复冻融。2.β-EP抗血清的制备2
2 1．β-EP 标准品，分子量为 1745。 2．0.5mmol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)。 3．Na 125I 溶液。 4．0.2%氯胺 T 溶液，用 0.05mmol/L PBS(pH7.5)现配。 5．0.2%偏亚硫酸钠溶液，用 0.05mmol/L PBS(pH7.5)配制。 6．0.1mol/L 醋酸溶液。 7．甲状腺球蛋白(TG)。 8．碳二亚胺。 9．福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。 10．百日咳疫苗。 11．PELH 缓冲液[0.1mol/L PBS (pH7.5)，含 3mmol/L EDTA-Na2，0.002%洗必泰，0.1% 溶菌酶]，β-EP 标准品、抗血清和 125I-β-EP 的稀释均用此缓冲液。 12．抑肽酶 用生理盐水溶解，使之每 20μl 含 500KIU，用于 1ml 全血。 13．2%加膜活性炭溶液 取活性炭 2g，葡聚糖 T70 0.2g，加入 0.1mol/L PBS(pH7.5)至 100ml，电磁搅拌 1h，然后置于 4℃备用。 【操作步骤】 1．125I-β-EP 标记 (1) 标记：将 β-EP 3μg 溶解于 30μl 的 0.5mol/L PBS (pH7.5)中，加 Na125I 2.9×107 Bq， 混匀后加新鲜配制的 0.2%氯胺 T 溶液 15μl，迅速振荡混匀，在室温下反应 75s，加入还原剂 0.2%偏亚硫酸钠溶液 40μl 终止碘化反应。 (2) 分离：将标记反应混合物注入 Bio-Gel P2 层析柱(0.75cm×25cm)，用 0.1mol/L 醋酸 溶液洗脱，每 min 收集一管，每管约 350μl，共收集 60 管，测定各收集管的放射性，出现两 个峰，第一个峰为 125I-β-EP，第二个峰为受损伤的抗原峰，第三个峰为游离的 Na 125I 峰。 (3) 标记抗原的检查：免疫化学活性的检查，以少量标记抗原与过量抗体反应，然后用 适当的方法分离 B 与 F，分别测定其放射性，观察其最大结合率，制备良好的标记抗原，其 最大结合率往往超过 90%，如最大结合率低于 70%，则此标记抗原不能使用。若经检查，受 损伤的抗原较多，应用适当的方法将之分离除去。此外游离碘(未与抗原结合的游离放射性碘) 应小于 5%。 (4) 贮存：合并第一个峰中计数最高的几管，测其比放射性，加入 1/8 体积的异丙醇， 分成若干小份，置于铅罐－20℃贮存可使用 2 个月，避免反复冻融。 2．β-EP 抗血清的制备
(1）免疫原合成：将β-EP1.5mg、TG15mg和碳二亚胺1mg分别溶解于双蒸水1.5ml、1.5ml和1ml双蒸水中，先把β-EP溶液与TG溶液混合，振荡。在不断搅拌下逐滴加入碳二亚胺溶液，加完再搅拌5min，在室温下反应2～3h即可。再加入等体积的福氏完全佐剂，制成乳剂，备用。(2)动物的选择：最常用的动物是家免或豚鼠，本实验选用新西兰纯种兔，雄性，以1.5~2.5kg为佳。多数情况下，并非每只动物都会产生满意的抗体，故往往同时给多个动物接种抗原，以便筛选。(3）免疫原的剂量：一般在0.1~1.0mg/kg体重，本实验选用0.25mgβ-EP/kg体重进行基础免疫，加强免疫时剂量减半。(4)免疫动物接种：常用颈背部皮内多点(20～30个点)注射。基础免疫使用完全佐剂同时在颈部皮下注射百日咳疫苗0.5ml。在基础免疫后15～20d开始加强免疫，每隔2周进行1次，B-EP免疫原的剂量减半，并且改用不完全佐剂，不再注射百日咳疫苗。经过4次(2个月)免疫注射后，隔1个月再加强免疫1次，一一般可获得高效价的抗血清。(5）抗血清效价的测定：从第2次加强开始，于免疫后12天左右，从实验兔耳缘静脉放血1～2ml，分离血清后用琼脂免疫电泳或放射免疫分析方法测定其抗血清效价。最后一次加强免疫后12天左右的抗血清效价可达1：20 000以上，即可通过抽血或动物放血，分离抗血清。(6）放血和分离抗血清：放血前动物应禁食12h，如欲将免疫免保留，则可从耳缘静脉放血或心脏穿刺取血(非致死放血量15~20ml/kg体重)。放血后应由静脉注入等量50%葡萄糖液，补充失血量，才能使动物存活。放血后的动物，经3个月休息后可再次免疫。放血必须在无菌条件下操作，收集的动物血液装入无菌离心管，待凝固后用无菌玻璃棒在无菌条件下把血块与容器壁剥离开，在37℃下放置1h，随后放入4℃过夜，使血清充分析出，次日在无菌条件下将血清吸出转移到无菌管进行分装，每管0.5~1.0ml，冷冻干燥或原液保存在一40℃冰箱内备用。3．血浆β-EP测定与校正曲线的建立（(1）血浆样品的处理：空腹时采集肘静脉血2ml，置于预冷含有0.3mol/LEDTA-Na240ul和抑肽酶1000KIU(40ul)的塑料离心管中，充分混匀，迅速3000r/min，4℃离心10min，分离出血浆置于一40℃冰箱保存待测。(2）无肽血浆的制备：在电磁搅拌下，吸取2%加膜活性炭溶液5ml，共2管，离心、弃上清。取健康者血浆5ml，倒入上述活性炭中，加盖，充分振荡10min，离心；上清液倒入另一活性炭管中，振荡10min，再离心，上清液即无肽血浆。血浆中的生物活性肽因被活性
3 (1) 免疫原合成：将 β-EP 1.5mg、TG 15mg 和碳二亚胺 1mg 分别溶解于双蒸水 1.5ml、 1.5ml 和 1ml 双蒸水中，先把 β-EP 溶液与 TG 溶液混合，振荡。在不断搅拌下逐滴加入碳二 亚胺溶液，加完再搅拌 5min，在室温下反应 2～3h 即可。再加入等体积的福氏完全佐剂，制 成乳剂，备用。 (2) 动物的选择：最常用的动物是家兔或豚鼠，本实验选用新西兰纯种兔，雄性，以 1.5～ 2.5kg 为佳。多数情况下，并非每只动物都会产生满意的抗体，故往往同时给多个动物接种抗 原，以便筛选。 (3) 免疫原的剂量：一般在 0.1～1.0mg/kg 体重，本实验选用 0.25mg β-EP/kg 体重进行基 础免疫，加强免疫时剂量减半。 (4) 免疫动物接种：常用颈背部皮内多点(20～30 个点)注射。基础免疫使用完全佐剂， 同时在颈部皮下注射百日咳疫苗 0.5ml。在基础免疫后 15～20d 开始加强免疫，每隔 2 周进行 1 次，β-EP 免疫原的剂量减半，并且改用不完全佐剂，不再注射百日咳疫苗。经过 4 次(2 个 月)免疫注射后，隔 1 个月再加强免疫 1 次，一般可获得高效价的抗血清。 (5) 抗血清效价的测定：从第 2 次加强开始，于免疫后 12 天左右，从实验兔耳缘静脉放 血 1～2ml，分离血清后用琼脂免疫电泳或放射免疫分析方法测定其抗血清效价。最后一次加 强免疫后 12 天左右的抗血清效价可达 1：20 000 以上，即可通过抽血或动物放血，分离抗血 清。 (6) 放血和分离抗血清：放血前动物应禁食 12h，如欲将免疫兔保留，则可从耳缘静脉 放血或心脏穿刺取血(非致死放血量 15～20ml/kg 体重)。放血后应由静脉注入等量 50%葡萄糖 液，补充失血量，才能使动物存活。放血后的动物，经 3 个月休息后可再次免疫。放血必须 在无菌条件下操作，收集的动物血液装入无菌离心管，待凝固后用无菌玻璃棒在无菌条件下 把血块与容器壁剥离开，在 37℃下放置 1h，随后放入 4℃过夜，使血清充分析出，次日在无 菌条件下将血清吸出转移到无菌管进行分装，每管 0.5～1.0ml，冷冻干燥或原液保存在－40℃ 冰箱内备用。 3．血浆 β-EP 测定与校正曲线的建立 (1) 血浆样品的处理：空腹时采集肘静脉血 2ml，置于预冷含有 0.3mol/L EDTA-Na2 40μl 和抑肽酶 1 000 KIU(40μl)的塑料离心管中，充分混匀，迅速 3 000r/min，4℃离心 10min，分 离出血浆置于－40℃冰箱保存待测。 (2) 无肽血浆的制备：在电磁搅拌下，吸取 2%加膜活性炭溶液 5ml，共 2 管，离心、 弃上清。取健康者血浆 5ml，倒入上述活性炭中，加盖，充分振荡 10min，离心；上清液倒入 另一活性炭管中，振荡 10min，再离心，上清液即无肽血浆。血浆中的生物活性肽因被活性
炭而去除。(3）配制标准溶液：按表17-1要求，β-EP标准品用PELH缓冲液配成每100u1含不同剂量的标准溶液。(4）配制抗血清：根据稀释曲线的结果，用PELH缓冲液将抗血清稀释成效价1：1000应用液。(5）配制1251β-EP标记抗原溶液：用PELH缓冲液将标记抗原配成每100u1含5000~15000cpm.(6）按顺序饱和加样法加样，详见表17-1。表 17-1血浆β-EP放射免疫分析法加样表(单位uI，反应总体积500uI)校正曲线血浆NSBBo5pg10pg50pg100pg500pgIng管号1-23-4 5-611-1219-207-89-1013-1415-1617-18B-EP标准液-1100100100100100100300血浆样品300300无肽血浆300300300300300300100 100100β-EP抗血清100100100100 100 PELH缓冲液100-混匀，在4℃下孵育12～24h1251β-EP100100100100100100100100100100注：T为总计数管，无需离心，直接测定cpm值。NSB为非特异性结合管即试剂空白管，Bo为零标准管。混匀，在4℃下孵育24h。每管加入2%加膜活性炭溶液300u1，摇匀，立即离心，分离B与F，弃上清(B)，用计数仪测定沉淀管(F)的cpm。【计算】“计数仪测定沉淀管的计数是F的cpm值，B=T-F-NSB。计算标准管与样品管B的cpm值。计算零标准管Bo的cpm值。计算结合率B/Bo%，以B/Bo%为纵坐标，以各标准管β-EP的含量为横坐标，用半对数坐标纸绘制校正曲线，根据血浆测定管的结合率B/Bo%，查校正曲线即可得出待测血浆β-EI的含量，再换算成每升血浆含β-EP的量
4 炭而去除。 (3) 配制标准溶液：按表 17-1 要求，β-EP 标准品用 PELH 缓冲液配成每 100μl 含不同剂 量的标准溶液。 (4) 配制抗血清：根据稀释曲线的结果，用 PELH 缓冲液将抗血清稀释成效价 1：1 000 应用液。 (5) 配制 125I β-EP 标记抗原溶液：用 PELH 缓冲液将标记抗原配成每 100μl 含 5 000～15 000cpm。 (6) 按顺序饱和加样法加样，详见表 17-1。 表 17-1 血浆 β-EP 放射免疫分析法加样表(单位μl，反应总体积 500μl) 校正曲线 血浆 T NSB B0 5pg 10pg 50pg 100pg 500pg 1ng 管号 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 13-14 15-16 17-18 19-20 β-EP 标准液 — — — 100 100 100 100 100 100 — 血浆样品 — — — — — — — — — 300 无肽血浆 — 300 300 300 300 300 300 300 300 — β-EP 抗血清 — — 100 100 100 100 100 100 100 100 PELH 缓冲液 — 100 — — — — — — — — 混匀，在 4℃下孵育 12～24h 125Iβ-EP 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 注：T 为总计数管，无需离心，直接测定 cpm 值。NSB 为非特异性结合管即试剂空白管， B0 为零标准管。 混匀，在 4℃下孵育 24h。每管加入 2%加膜活性炭溶液 300μl，摇匀，立即离心，分离 B 与 F，弃上清(B)，用γ计数仪测定沉淀管(F)的 cpm。 【计算】 γ计数仪测定沉淀管的计数是 F 的 cpm 值，B=T－F－NSB。 计算标准管与样品管 B 的 cpm 值。 计算零标准管 B0 的 cpm 值。 计算结合率 B/B0 %，以 B/B0 %为纵坐标，以各标准管 β-EP 的含量为横坐标，用半对数 坐标纸绘制校正曲线，根据血浆测定管的结合率 B/B0 %，查校正曲线即可得出待测血浆 β-EP 的含量，再换算成每升血浆含 β-EP 的量
【参考范围】536.5±281.4ng/L或307.4土±161.3pmo/L（不同公司的试剂盒参考范围有所不同)。【临床意义】β-EP在镇痛、调节呼吸、循环、消化、免疫、运动功能和丘脑-垂体-肾上腺轴功能方面起重要作用，而且还参与休克、中风、头痛、癫痫和脑脊髓损伤的病理过程。肺炎、无痛性心肌缺血、急性心肌梗塞、心力衰竭、心源性休克、出血性休克、烧伤、多囊卵巢综合征等患者血浆中β-EP升高，颅脑损伤、癫痫等患者的脑脊液中β-EP升高，此外肥胖者血浆 β-EP也可升高。偏头痛、更年期综合征等疾病血浆中 β-EP降低，帕金森病患者脑脊液中 β-EP 降低。【注意事项】目前临床检测β-EP多采用放射免疫试剂盒，标记抗原和抗血清均已制备好，与试剂盒配套供应，检测时只需制备校正曲线和样品，按操作规程进行操作，大大简化了实验过程。但由于不同厂家生产的试剂盒，由于方法学及抗血清特异性的差异，测定值可能会有差别，参考范围也有所不同。【评价】最小检出量0.5pg/管，回收率为94~103%，批内CV为5%，批间CV<12%。实验124放射免疫法测定血浆P物质【原理】P物质(substanceP，SP)于1931年发现，是最早发现的一种神经肽。1971年证明它是11 肽(Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-GIn-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2)，分子量为1348。目前已可人工合成纯品。由于血浆中SP含量低，临床上多采用灵敏度高的放射免疫法进行检测其含量。放射免疫分析法原理基本同实验123，一是标记抗原125ISP、二是制备SP抗血清、三是分离标记抗原-抗体复合物(B)与游离标记抗原(F)，用-计数仪计数B的放射活性，根据校正曲线和待测血浆样品的结合率B/Bo%，即可求得血浆中SP的含量。【试剂】1.PELH缓冲液[0.1mol/LPBS(pH7.5)，含3mmol/LEDTA-Na2，0.002%洗必泰，0.1%溶菌酶]，SP标准品、抗血清和 1251-SP的稀释均用此缓冲液。2.SP贮存液取SP(纯度97%)1.4mg溶于0.1mol/L醋酸100ml中，此液浓度约为10umol/L，然后用PELH缓冲液稀释至100nmol/L，分装，一20℃保存。3.SP工作液取贮存液，用PELH缓冲液稀释至80和240pmol/L两种浓度4.0.5mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)。5.0.1mol/L醋酸溶液。6.甲状腺球蛋白(TG)
5 【参考范围】 536.5±281.4ng/L 或 307.4±161.3 pmol/L (不同公司的试剂盒参考范围有 所不同)。 【临床意义】 β-EP 在镇痛、调节呼吸、循环、消化、免疫、运动功能和丘脑-垂体-肾 上腺轴功能方面起重要作用，而且还参与休克、中风、头痛、癫痫和脑脊髓损伤的病理过程。 肺炎、无痛性心肌缺血、急性心肌梗塞、心力衰竭、心源性休克、出血性休克、烧伤、多囊 卵巢综合征等患者血浆中 β-EP 升高，颅脑损伤、癫痫等患者的脑脊液中 β-EP 升高，此外肥 胖者血浆 β-EP 也可升高。偏头痛、更年期综合征等疾病血浆中 β-EP 降低，帕金森病患者脑 脊液中 β-EP 降低。 【注意事项】 目前临床检测 β-EP 多采用放射免疫试剂盒，标记抗原和抗血清均已制备 好，与试剂盒配套供应，检测时只需制备校正曲线和样品，按操作规程进行操作，大大简化 了实验过程。但由于不同厂家生产的试剂盒，由于方法学及抗血清特异性的差异，测定值可 能会有差别，参考范围也有所不同。 【评价】 最小检出量 0.5pg/管，回收率为 94～103%，批内 CV 为 5%，批间 CV＜12%。 实验 124 放射免疫法测定血浆 P 物质 【原理】 P 物质(substance P，SP)于 1931 年发现，是最早发现的一种神经肽。1971 年 证明它是 11 肽(Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2)，分子量为 1348。目前已 可人工合成纯品。由于血浆中 SP 含量低，临床上多采用灵敏度高的放射免疫法进行检测其含 量。放射免疫分析法原理基本同实验 123，一是标记抗原 125I SP、二是制备 SP 抗血清、三是 分离标记抗原-抗体复合物(B)与游离标记抗原(F)，用γ-计数仪计数 B 的放射活性，根据校正 曲线和待测血浆样品的结合率 B/B0 %，即可求得血浆中 SP 的含量。 【试剂】 1．PELH 缓冲液[0.1mol/L PBS (pH7.5)，含 3mmol/L EDTA-Na2，0.002%洗必泰，0.1%溶 菌酶]，SP 标准品、抗血清和 125I-SP 的稀释均用此缓冲液。 2．SP 贮存液 取 SP(纯度 97%) 1.4mg 溶于 0.1mol/L 醋酸 100ml 中，此液浓度约为 10 μmol/L，然后用 PELH 缓冲液稀释至 100nmol/L，分装，－20℃保存。 3．SP 工作液 取贮存液，用 PELH 缓冲液稀释至 80 和 240 pmol/L 两种浓度。 4．0.5mmol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)。 5．0.1mol/L 醋酸溶液。 6．甲状腺球蛋白(TG)