第十三章非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最终代谢产物氨，含血红素蛋白的代谢产物胆红素，以及肝脏合成的胆汁酸。尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标，尿酸水平还能反映嘌呤代谢紊乱的情况；尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标，胆红素和胆汁酸可反映肝胆功能。第一节血清尿素测定检测尿素的方法有二乙酰一法、半酶法和全酶法。二乙酰一法需煮沸反应，检测精密度较差，目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素转变成的氨，氨的测定方法有：①离子选择性电极法：②用波氏比色法；③干化学法。脲酶波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。实验 79二乙酰一法测定血清尿素【原理】二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一与强酸作用产生二乙酰。【试剂】1.酸性试剂在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸44ml、85%磷酸66ml冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g，溶解后用去离子水稀释至1L。置棕色瓶中，4℃可保存半年。2.179.9mmo/L二乙酰一溶液称二乙酰一20g溶于去离子水中并定容至1L。置棕色瓶中，4℃可保存半年。3尿素标准贮存液(100mmol/L）精确称取于60~65℃干燥恒重的尿素(Mw为60.06)0.6g，溶解于无氮去离子水，并定容至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。4.尿素标准应用液(5mmol/L）取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。【操作步骤】按表13-1操作。1
1 第十三章 非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定 非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌 呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最 终代谢产物氨，含血红素蛋白的代谢产物胆红素，以及肝脏合成的胆汁酸。 尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标，尿酸水平还能反映嘌呤 代谢紊乱的情况；尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标，胆红素和 胆汁酸可反映肝胆功能。 第一节 血清尿素测定 检测尿素的方法有二乙酰一肟法、半酶法和全酶法。二乙酰一肟法需煮沸反应，检测精 密度较差，目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素 转变成的氨，氨的测定方法有：①离子选择性电极法；②用波氏比色法；③干化学法。脲酶 －波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测 定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。 实验 79 二乙酰一肟法测定血清尿素 【原理】 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的 4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜 色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 【试剂】 1．酸性试剂 在三角烧瓶中加去离子水约 100ml，然后加入浓硫酸 44ml、85%磷酸 66ml。 冷至室温，加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g，溶解后用去离子水稀释至 1L。 置棕色瓶中，4℃可保存半年。 2．179.9mmol/L 二乙酰一肟溶液 称二乙酰一肟 20g 溶于去离子水中并定容至 1L。置棕 色瓶中，4℃可保存半年。 3．尿素标准贮存液(100mmol/L) 精确称取于 60～65℃干燥恒重的尿素(Mw 为 60.06)0.6g，溶解于无氨去离子水，并定容至 100ml，加 0.1g 叠氮钠防腐，4℃可保存 6 个月。 4．尿素标准应用液(5mmol/L) 取 5ml 上述贮存液用无氨去离子水稀释至 100ml。 【操作步骤】 按表 13-1 操作
表13-1二乙酰一法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.020.02 尿素标准应用液去离子水0.020.50.5二乙酰一溶液0.55.05.0酸性试剂5.0混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。【计算】尿素(mml /L)=会个期定×5A标【参考范围】血清尿素1.78~7.14mmol/L。【临床意义】1.血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。(1）生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。(2)病理因素1）肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加2）肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾孟肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高3）肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。【注意事项】1.试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，（每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。3.尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮(1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮)；另外还有以尿素氮
2 表 13-1 二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.02 尿素标准应用液 － 0.02 － 去离子水 0.02 － － 二乙酰一肟溶液 0.5 0.5 0.5 酸性试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，置沸水浴加热 12min，取出置冷水中冷却 5min，以空白管调零，在 540nm 处读取 各管吸光度。 【计算】 5 A A (mmol / L) = 标准 尿素 测定 【参考范围】 血清尿素 1.78～7.14mmol/L。 【临床意义】 1．血液尿素浓度增高 分生理性和病理性因素两方面。 (1) 生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性 比女性平均高 0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为 0.63mmol/L。 (2) 病理因素 1) 肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致 血液尿素浓度增加。 2) 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小 球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。 3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、 尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。 【注意事项】 1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象， (每小时小于 5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。 2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作 50 倍以上稀释。 3．尿素浓度以前习惯用尿素氮 mg/dl 表示，因为一个尿素分子中有 2 个氮原子，所以 1mmol 尿素相当于 28mg 尿素氮(1mmol/L 尿素相当于 2.8mg/dL 尿素氮)；另外还有以尿素氮
mmol/L表示，则1mmol/L尿素=2mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。【评价】1．本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。2.线性上限仅达7.14mmol/L；回收率为96%~102.1%。3.二乙酰一法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171umol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。实验80脲酶一波氏比色法测定血清尿素【原理】脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长处有吸收峰。【试剂】1．酚显色剂苯酚10g，亚硝基铁氰化钠(含2分子水)0.05g，溶于1L无氨去离子水中，存放4℃可保存2个月。2.碱性次氯酸钠溶液氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml(相当于次氯酸钠0.42g)，再加无氨去离子水至1L，置棕色瓶内，4℃可保存2个月。3.脲酶贮存液脲酶(比活性3000~4000U/g)0.2g置于20ml50%(V/V)甘油中，4℃可保存6个月。4.脲酶应用液发脲酶贮存液1ml，加10g/LEDTA-Na2溶液(pH6.5)至100ml，4℃保存可稳定1个月。5.尿素标准液(5.0mmol/L）见二乙酰一肟法。【操作步骤】按表13-2 操作。3
3 mmol/L 表示，则 1mmol/L 尿素＝2mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用 mmol/L 表示， 我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。 【评价】 1．本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达 到 100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用 在水浴锅底部加置高约 5mm 的网垫，在网垫上加热显色，可使 CV 由不加网垫时的 6.46%降 至 2.99%。 2．线性上限仅达 7.14mmol/L；回收率为 96%～102.1%。 3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会 有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化 合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但 这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达 171μmol/L、血红蛋白达 10g/L 均无影响。 实验 80 脲酶－波氏比色法测定血清尿素 【原理】 脲酶水解尿素产生 2 分子氨和 1 分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次 氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚 的生成量与尿素含量成正比，在 630nm 波长处有吸收峰。 【试剂】 1．酚显色剂 苯酚 10g，亚硝基铁氰化钠(含 2 分子水)0.05g，溶于 1L 无氨去离子水中， 存放 4℃可保存 2 个月。 2．碱性次氯酸钠溶液 氢氧化钠 5g 溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml(相当于次 氯酸钠 0.42g)，再加无氨去离子水至 1L，置棕色瓶内，4℃可保存 2 个月。 3．脲酶贮存液 脲酶(比活性 3 000～4 000U/g)0.2g 置于 20ml 50%(V/V)甘油中，4℃可保 存 6 个月。 4．脲酶应用液 脲酶贮存液 1ml，加 10g/L EDTA-Na2 溶液(pH6.5)至 100ml，4℃保存可 稳定 1 个月。 5．尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法。 【操作步骤】 按表 13-2 操作
表13-2脲酶-波氏比色法操作步骤加入物(ml)测定管标准管空白管脲酶应用液1.01.01.0血福0.01一尿素标准液 0.01 一无氨去离子水0.01混匀，37℃水浴15min酚显色剂5.05.05.0碱性次氯酸钠5.05.05.0混匀，置37℃水浴20min。波长630nm，空白管调零，读取吸光度。【计算】=A测定×5尿素(mmol /L)=A标准【参考范围】同二乙酰一法(实验79)。【注意事项】1.本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而测定尿氨时氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。2．空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。【评价】1．呈色稳定性在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.01~0.02。2.本法批内CV<1.8%，批间CV<2.7%；回收率96.71%~103.35%；与酶偶联法对照测定病人标本37例，相关系数(r)为0.972；线性范围较宽，达17.58mmol/L3．大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在34.2umol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.65~68.4uμmol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。实验81酶偶联速率法测定血清尿素4
4 表 13-2 脲酶-波氏比色法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 脲酶应用液 1.0 1.0 1.0 血 清 0.01 — — 尿素标准液 — 0.01 — 无氨去离子水 — — 0.01 混匀，37℃水浴 15min 酚显色剂 5.0 5.0 5.0 碱性次氯酸钠 5.0 5.0 5.0 混匀，置 37℃水浴 20min。波长 630nm，空白管调零，读取吸光度。 【计算】 ( / ) = 5 标准 尿素 测定 A A mmol L 【参考范围】 同二乙酰一肟法(实验 79)。 【注意事项】 1．本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多 1 000 多倍，因而测定尿氨时， 氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。 2．空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物 可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。 【评价】 1．呈色稳定性 在 1h 内吸光度的波动仅为 0.005，12h 后较最初吸光度读数也仅增高 0.01～0.02。 2．本法批内 CV＜1.8%，批间 CV＜2.7%；回收率 96.71%～103.35%；与酶偶联法对照 测定病人标本 37 例，相关系数(r)为 0.972；线性范围较宽，达 17.58mmol/L。 3．大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气 8d 后，测定值上升 1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在 34.2μ mol/L 以上时尿素测定值有不同程度的降低，在 25.65～68.4μmol/L 之间时，平均降低 0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。 实验 81 酶偶联速率法测定血清尿素
【原理】尿素经脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶1作用生成谷氨酸与氧化型辅酶I。还原型辅酶I在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。其反应式如下：尿素+H,O_尿素蒂→2NH,+CO,NH,+α-酮戊二酸+NADH+H+GLDH>谷氨酸+NAD*+H,0【试剂】1．酶试剂试剂成分和在反应液中的参考浓度如下：pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液150mmol/L脲酶8 000U/L700 U/L谷氨酸脱氢酶(GLDH)还原型辅酶I(NADH)0.3mmol/Lα-酮戊二酸15mmol/LADP1.5mmol/L目前较多采用双试剂法，脲酶和NADH单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同方法，使试剂有效期有所不同。2.尿素标准液(5.0mmol/L）见二乙酰一法(实验79)。【操作步骤】按表13-3操作。表13-3酶偶联速率法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.0150.015尿素标准应用液无氨去离子水0.0151.51.5 酶试剂1.5混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(AA/min)。测定参数温度37℃，波长340nm，平衡时间30s，读数时间30s，样品/反应总体积为1101。本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。(二测定M/mmn-空自A/mx5【计算】尿素(mmol/ L)=标准^A/min-空白A/min5
5 【原理】 尿素经脲酶催化水解生成 2 分子氨及 1 分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化 下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶Ⅰ作用生成谷氨酸与氧化型辅酶Ⅰ。还原型辅酶Ⅰ在 340nm 波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。其反应式如下： NH NADH H NAD H O H O 2NH CO 2 GLDH 3 2 3 2 + − + + ⎯⎯⎯→ + + + ⎯⎯⎯→ + 酮戊二酸 + 谷氨酸 + 尿素 尿素酶 【试剂】 1．酶试剂 试剂成分和在反应液中的参考浓度如下： pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液 150mmol/L 脲酶 8 000U/L 谷氨酸脱氢酶(GLDH) 700 U/L 还原型辅酶Ⅰ(NADH) 0.3mmol/L α-酮戊二酸 15mmol/L ADP 1.5mmol/L 目前较多采用双试剂法，脲酶和 NADH 单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同 方法，使试剂有效期有所不同。 2．尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法(实验 79)。 【操作步骤】 按表 13-3 操作。 表 13-3 酶偶联速率法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.015 尿素标准应用液 － 0.015 － 无氨去离子水 0.015 － － 酶试剂 1.5 1.5 1.5 混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(ΔA/min)。 测定参数 温度 37℃，波长 340nm，平衡时间 30s，读数时间 30s，样品/反应总体积为 1∶ 101。本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。 【计算】 5 min min min min ( / ) − − = A A A A mmol L 标准 空白 测定 空白 尿素