膜失去疏基保护，最终导致溶血。【注意事项】1.溶血液制备后应立即测定酶活性或于冰箱保存，否则酶活性易下降。2.若采血后不能即时测定，最好加入酸性枸橡酸葡萄糖(ACD)保养液保存3.若6次读数△A/min相差较大，应增加读数次数直至△A/min接近为止。实验96邻联大回香胺比色法测定血清铜蓝蛋白铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)是存在于血清、肝、肾中含铜的a2-糖蛋白，每个CP分子含有6～8个铜原子，其中Cu2+、Cu*各占一半，故呈蓝色。CP具有铁氧化还原酶活性，能使Fe2+氧化成Fe3+，又称为亚铁氧化酶(ferroxidase)。CP的酶活性相对而言是非专一性的，其催化的基质包括一些多元醇、多元酚、多元胺等。可以用Fe2+、联苯胺、对-苯二胺、N-N-二甲基苯二胺、邻联大回香胺等作为底物，测定其酶的活性，其最适pH在5.0～6.0之间。也可用免疫化学方法对CP进行定量测定。【原理】以邻联大回香胺二盐酸盐作为底物，在CP的催化下生成淡棕黄色的产物，然后加酸终止反应，并生成紫红色的溶液。根据紫红色颜色的深浅来判断CP酶活性。【试剂】1.醋酸盐缓冲液(pH5.0）准确称取醋酸钠(含三分子结晶水)13.608g或无水醋酸钠8.204g溶解于蒸馏水中，倒入1L容量瓶中加蒸馏水至约990ml，再加入冰醋酸2.6ml，混匀后用0.1mol/LNaOH或冰醋酸校正pH至5.0，最后用蒸馏水补充体积至1000ml，于4℃保存。2.9.0mol/L硫酸溶液取浓硫酸逐滴加入等体积的蒸馏水混合即成。3.7.88mmol/L邻联大回香胺二盐酸盐溶液准确称取邻联大回香胺二盐酸盐250mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，贮存于棕色瓶中4℃保存，至少可稳定3个月。【操作步骤】按表14-4操作。表14-4邻联大回香胺法测定CP活性试剂(ml)1管(5min管）2管(15min管）血清0.050.05醋酸盐缓冲液0.750.7530℃水浴5min，平衡温度
11 膜失去巯基保护，最终导致溶血。 【注意事项】 1．溶血液制备后应立即测定酶活性或于冰箱保存，否则酶活性易下降。 2．若采血后不能即时测定，最好加入酸性枸橼酸葡萄糖(ACD)保养液保存。 3．若 6 次读数△A/min 相差较大，应增加读数次数直至△A/min 接近为止。 实验 96 邻联大回香胺比色法测定血清铜蓝蛋白 铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)是存在于血清、肝、肾中含铜的α2-糖蛋白，每个 CP 分子 含有 6～8 个铜原子，其中 Cu2+、Cu+各占一半，故呈蓝色。CP 具有铁氧化还原酶活性，能使 Fe2+氧化成 Fe3+，又称为亚铁氧化酶(ferroxidase)。CP 的酶活性相对而言是非专一性的，其催 化的基质包括一些多元醇、多元酚、多元胺等。可以用 Fe2+、联苯胺、对-苯二胺、N-N-二甲 基苯二胺、邻联大回香胺等作为底物，测定其酶的活性，其最适 pH 在 5.0～6.0 之间。也可 用免疫化学方法对 CP 进行定量测定。 【原理】 以邻联大回香胺二盐酸盐作为底物，在 CP 的催化下生成淡棕黄色的产物， 然后加酸终止反应，并生成紫红色的溶液。根据紫红色颜色的深浅来判断 CP 酶活性。 【试剂】 1．醋酸盐缓冲液(pH5.0) 准确称取醋酸钠(含三分子结晶水)13.608g 或无水醋酸钠 8.204g 溶解于蒸馏水中，倒入 1 L 容量瓶中加蒸馏水至约 990ml，再加入冰醋酸 2.6ml，混匀后用 0.1mol/L NaOH 或冰醋酸校正 pH 至 5.0，最后用蒸馏水补充体积至 1 000ml，于 4℃保存。 2．9.0mol/L 硫酸溶液 取浓硫酸逐滴加入等体积的蒸馏水混合即成。 3．7.88mmol/L 邻联大回香胺二盐酸盐溶液 准确称取邻联大回香胺二盐酸盐 250mg ， 加蒸馏水溶解并定容至 100ml，贮存于棕色瓶中 4℃保存，至少可稳定 3 个月。 【操作步骤】 按表 14-4 操作。 表 14-4 邻联大回香胺法测定 CP 活性 试剂(ml) 1 管(5min 管) 2 管(15min 管) 血清 0.05 0.05 醋酸盐缓冲液 0.75 0.75 30℃水浴 5min，平衡温度
邻联大回香胺二盐酸盐0.2 0.2 溶液(事先30℃预温)准确反应5min后9.0mol/L硫酸溶液2.0(立即混匀，由水浴中取出)准确反应10min 后9.0mol/L硫酸溶液2.0(立即混匀，由水浴中取出)用1cm光径比色杯在540nm波长下测定吸光度值，蒸馏水调零。【计算】CP国际单位的定义为：在最适pH和底物浓度下，每分钟能催化1umol底物所需的酶量为一个国际单位。A15CP活性（IUIL)=x1000om10*0.059.46=(A15min-A5min)X6.34×102式中，A15min：15min管的吸光度；A5mh：5min管的吸光度；9.46：吸光系数；10：孵育时间之差值；0.05：血清用量(ml)；3：反应液总体积(ml)。【参考范围】 62~140IU/L。【临床意义】CP是一种急性时相反应蛋白，在炎症、感染、创伤、肿瘤等情况下血清水平会增加。传染病、白血病、缺铁性贫血、霍奇金病、多数肝转移瘤、胆石症及肿瘤引起的胆道阻塞等CP会增高，另外口服避孕药以及妊娠后三个月时血清中浓度也会升高。血清 CP 浓度下降主要见于 Wilson 病(肝豆状核变性)，这也是本病的特征，同时伴有血浆可透析铜含量增加。同时血清CP水平下降也见于肾病综合征、营养不良等。【注意事项】1.加入硫酸需立即混匀以终止酶促反应。2.实验过程中需要严格控制温度和pH值3．标本一般采用血清，4℃下可稳定3d，一20℃可稳定4周。用柠檬酸、EDTA抗凝血浆对本法测定有干扰【评价】本法是基于CP氧化酶活性测定的优先选择方法，其底物和生成的产物都十分稳定。但酶法易受干扰，在实验过程中必须严格控制温度和 pH值。实验97芒醛偶氮萘酚法测定血清单胺氧化酶12
12 邻联大回香胺二盐酸盐 溶液(事先 30℃预温) 0.2 0.2 准确反应 5min 后 9.0mol/L 硫酸溶液 2.0(立即混匀，由水浴中取出) － 准确反应 10min 后 9.0mol/L 硫酸溶液 － 2.0(立即混匀，由水浴中取出) 用 1cm 光径比色杯在 540nm 波长下测定吸光度值，蒸馏水调零。 【计算】 CP 国际单位的定义为：在最适 pH 和底物浓度下，每分钟能催化 1μmol 底 物所需的酶量为一个国际单位。 1000 0.05 3 10 1 9.46 A A / 15min 5min − CP活性（IU L）= ＝(A15min-A5min)×6.34×102 式中，A15min：15min 管的吸光度；A5min ：5min 管的吸光度；9.46：吸光系数；10：孵 育时间之差值；0.05：血清用量(ml)；3：反应液总体积(ml)。 【参考范围】 62～140 IU/L。 【临床意义】 CP 是一种急性时相反应蛋白，在炎症、感染、创伤、肿瘤等情况下血 清水平会增加。传染病、白血病、缺铁性贫血、霍奇金病、多数肝转移瘤、胆石症及肿瘤引 起的胆道阻塞等 CP 会增高，另外口服避孕药以及妊娠后三个月时血清中浓度也会升高。 血清 CP 浓度下降主要见于 Wilson 病(肝豆状核变性)，这也是本病的特征，同时伴有血 浆可透析铜含量增加。同时血清 CP 水平下降也见于肾病综合征、营养不良等。 【注意事项】 1．加入硫酸需立即混匀以终止酶促反应。 2．实验过程中需要严格控制温度和 pH 值。 3．标本一般采用血清，4℃下可稳定 3d，－20℃可稳定 4 周。用柠檬酸、EDTA 抗凝血 浆对本法测定有干扰。 【评价】 本法是基于 CP 氧化酶活性测定的优先选择方法，其底物和生成的产物都十 分稳定。但酶法易受干扰，在实验过程中必须严格控制温度和 pH 值。 实验 97 苄醛偶氮萘酚法测定血清单胺氧化酶
单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)是一类细胞外酶，含有铜离子，分布在肝、肾等组织的线粒体中，其含量分布为肝>心>肾>脑>肺>骨骼肌，血小板和胎盘中也含有MAO。线粒体中的MAO与膜紧密结合，仅少量为可溶性，存在于细胞质中。血清中MAO为水溶性，与结缔组织中MAO相似，但与线粒体MAO不同。体内MAO的底物特异性不高，主要作用于一CH一NHz基团，在氧的参与下催化一种单胺氧化生成相应的醛、氨和过氧化氢。目前的测定方法有分光光度法、荧光法和免疫抑制法。比色法所采用的底物有芊胺偶氮-β-萘酚、苄胺和正丁胺等。【原理】以苄胺偶氮-β-萘酚为基质，在O2与H2O参与下，37℃经MAO作用生成节醛偶氮-β-萘酚、氨和过氧化氢，再经环己烷提取苄醛偶氮-β-萘酚，在500nm处比色，被提取物含量与MAO 活性成正比，与已知量的对苄醛偶氮-β-萘酚相比即可求出MAO的活性单位。【试剂】1.0.1mol/LTris-HCI缓冲液(pH7.2）称取Tris12.1g，用蒸馏水溶解，加入Imol/LHC约85ml，调节pH至7.2，加蒸馏水至1000ml。2.0.5mmol/L苄胺偶氮-β-萘酚缓冲液（基质缓冲液）称取13.8mg苄胺偶氮-β-萘酚，放入3支大试管中，分别用0.1mol/LTris-HCI缓冲液(pH7.2)在水浴加热条件下逐步溶解色素部分至100ml，最后弃去黑色不溶物质。冰箱可保存3周。3.100nmol/ml对醛偶氮-β-萘酚标准液准确称取对苄醛偶氮-β-萘酚2.77mg，用10ml无水乙醇溶解，然后再用无水乙醇加至100ml。4℃冰箱可保存数月。4.10%(W/V)过氯酸用蒸馏水将60%过氯酸8ml或70%过氯酸7ml稀释至50ml而成。【操作步骤】取10ml带塞试管3支，按表14-5操作。表14-5芊醛偶氮萘酚法测定MAO活性试剂(ml)空白管(B)标准管(S)测定管(U)血清0.5-对苄醛偶氮-β-萘酚标准液-0.5 一0.5蒸馏水-2.02.02.0基质缓冲液(预温至37℃)混匀，37℃水浴60min10%过氯酸溶液3 滴3滴3滴
13 单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)是一类细胞外酶，含有铜离子，分布在肝、肾等 组织的线粒体中，其含量分布为肝＞心＞肾＞脑＞肺＞骨骼肌，血小板和胎盘中也含有 MAO。 线粒体中的 MAO 与膜紧密结合，仅少量为可溶性，存在于细胞质中。血清中 MAO 为水溶 性，与结缔组织中 MAO 相似，但与线粒体 MAO 不同。体内 MAO 的底物特异性不高，主要 作用于—CH―NH2 基团，在氧的参与下催化一种单胺氧化生成相应的醛、氨和过氧化氢。目 前的测定方法有分光光度法、荧光法和免疫抑制法。比色法所采用的底物有苄胺偶氮-β-萘 酚、苄胺和正丁胺等。 【原理】 以苄胺偶氮-β-萘酚为基质，在 O2 与 H2O 参与下，37℃经 MAO 作用生成苄 醛偶氮-β-萘酚、氨和过氧化氢，再经环己烷提取苄醛偶氮-β-萘酚，在 500nm 处比色，被提 取物含量与 MAO 活性成正比，与已知量的对苄醛偶氮-β-萘酚相比即可求出 MAO 的活性单 位。 【试剂】 1．0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.2) 称取 Tris 12.1g，用蒸馏水溶解，加入 1mol/L HCl 约 85ml，调节 pH 至 7.2，加蒸馏水至 1 000ml。 2．0.5mmol/L 苄胺偶氮-β-萘酚缓冲液(基质缓冲液) 称取 13.8mg 苄胺偶氮-β-萘酚， 放入 3 支大试管中，分别用 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.2)在水浴加热条件下逐步溶解色素 部分至 100ml，最后弃去黑色不溶物质。冰箱可保存 3 周。 3．100nmol/ml 对苄醛偶氮-β-萘酚标准液 准确称取对苄醛偶氮-β-萘酚 2.77mg，用 10ml 无水乙醇溶解，然后再用无水乙醇加至 100ml。4℃冰箱可保存数月。 4．10%(W/V)过氯酸 用蒸馏水将 60%过氯酸 8ml 或 70%过氯酸 7ml 稀释至 50ml 而成。 【操作步骤】 取 10ml 带塞试管 3 支，按表 14-5 操作。 表 14-5 苄醛偶氮萘酚法测定 MAO 活性 试剂(ml) 空白管(B) 标准管(S) 测定管(U) 血清 － － 0.5 对苄醛偶氮-β-萘酚标准液 － 0.5 － 蒸馏水 0.5 － － 基质缓冲液(预温至 37℃) 2.0 2.0 2.0 混匀，37℃水浴 60min 10%过氯酸溶液 3 滴 3 滴 3 滴
环已烷4.04.04.0加塞振荡5min，置37℃水浴30min，其间用玻棒搅拌2次，取出试管以3000r/min离心10min，取上清液500nm比色，用空白管调零，分别读取标准管与测定管吸光度。【计算】MAO活性单位的定义为：1ml血清在37℃作用基质60min产生1nmol对节醛偶氮-β-萘酚为一个单位。故测定管吸光度×100MAO活性（UImI)标准管吸光度12~40 U/ml (12 000~40 000U/L)【参考范围】【临床意义】临床上MAO的测定主要用于肝硬化的诊断。肝硬化时血清MAO活性平均比正常升高3倍，且阳性率可达到80%以上，早期肝硬化病人尤为明显；而急、慢性肝炎时血清MAO活性大多数正常，仅部分有轻度增高；急性坏死性肝炎时由于MAO从肝细胞逸出增加导致血清酶活性升高；慢性肝炎活动期血清MAO活性有增高的趋势；严重脂肪肝病人MAO亦升高。神经系统病变如 Alzheimer 病、Parkinson 病和抑郁症病人血清和脑内 MAO 活性明显升高，血清MAO 活性升高还见于糖尿病、甲状腺功能亢进、肢端肥大症、心力衰竭所致的肝淤血等疾病。【注意事项】1.对芊醛偶氮-β-萘酚不易溶解，必须在热水浴中逐步洗下其色素，直至只剩下黑色不溶物质。2．环已烷的作用是提取生成的卡醛化合物，为了充分抽提，需放置37℃水浴30min，并搅拌1～2次，使其充分乳化，完全抽提。3.环已烷抽提物的吸收峰在480nm，为了减少胆红素的干扰采用500nm作为检测波长。4．环已烷与水不能互溶，因此比色杯必须先用无水乙醇和乙醚清洗干净，干燥后才能使用。否则，会形成浑浊而无法测定。【评价】以对苄醛偶氮-β-酚作为底物，所测得的MAO活性较其他底物更高，但本法需要用环已烷抽提，操作较繁琐，限制了本法的实用性，也不适合于全自动生化仪分析实验98邻苯三酚自氧化抑制法测定超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一类金属酶，按其辅基不同可分为14
14 环己烷 4.0 4.0 4.0 加塞振荡 5min，置 37℃水浴 30min，其间用玻棒搅拌 2 次，取出试管以 3 000r/min 离心 10min，取上清液 500nm 比色，用空白管调零，分别读取标准管与测定管吸光度。 【计算】 MAO 活性单位的定义为：1ml 血清在 37℃作用基质 60min 产生 1nmol 对苄 醛偶氮-β-萘酚为一个单位。故 / = 100 标准管吸光度 测定管吸光度 MAO活性（U ml） 【参考范围】 12～40 U/ml (12 000～40 000U/L) 【临床意义】 临床上 MAO 的测定主要用于肝硬化的诊断。肝硬化时血清 MAO 活性 平均比正常升高 3 倍，且阳性率可达到 80%以上，早期肝硬化病人尤为明显；而急、慢性肝 炎时血清 MAO 活性大多数正常，仅部分有轻度增高；急性坏死性肝炎时由于 MAO 从肝细 胞逸出增加导致血清酶活性升高；慢性肝炎活动期血清 MAO 活性有增高的趋势；严重脂肪 肝病人 MAO 亦升高。 神经系统病变如 Alzheimer 病、Parkinson 病和抑郁症病人血清和脑内 MAO 活性明显升 高，血清 MAO 活性升高还见于糖尿病、甲状腺功能亢进、肢端肥大症、心力衰竭所致的肝 淤血等疾病。 【注意事项】 1．对苄醛偶氮-β-萘酚不易溶解，必须在热水浴中逐步洗下其色素，直至只剩下黑色不 溶物质。 2．环己烷的作用是提取生成的卞醛化合物，为了充分抽提，需放置 37℃水浴 30min， 并搅拌 1～2 次，使其充分乳化，完全抽提。 3．环己烷抽提物的吸收峰在 480nm，为了减少胆红素的干扰采用 500nm 作为检测波长。 4．环己烷与水不能互溶，因此比色杯必须先用无水乙醇和乙醚清洗干净，干燥后才能 使用。否则，会形成浑浊而无法测定。 【评价】 以对苄醛偶氮-β-萘酚作为底物，所测得的 MAO 活性较其他底物更高，但 本法需要用环己烷抽提，操作较繁琐，限制了本法的实用性，也不适合于全自动生化仪分析。 实验 98 邻苯三酚自氧化抑制法测定超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一类金属酶，按其辅基不同可分为
CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD几类，广泛分布于生物细胞体内，其含量以肝脏最高，其次为肾脏，红细胞中含量也很高。红细胞中SOD属于CuZn-SOD。体内SOD能够特异地催化超氧化物阴离子发生歧化反应，再由过氧化氢酶转化为H2O和O2，从而消除超氧化物阴离子的毒性作用。目前测定方法有化学比色法、化学发光法、免疫法、电化学法和电泳法等。【原理】邻苯三酚在碱性条件下能迅速发生自氧化，SOD能抑制邻苯三酚的自氧化反应。在420nm处0.2mmol/L邻苯三酚的自氧化速率为0.060/min，25℃条件下SOD作用4min后用HCI中止反应，根据抑制率高低计算出红细胞SOD的活性。【试剂与器材】1.Tris-HCI缓冲液(pH8.2，含0.1mol/LTris、2mmol/LEDTA）分别取0.2mol/LTris溶液(含4mmol/LEDTA)100ml和0.2mol/LHCI溶液44.76ml，混合后加蒸馏水至200ml混匀备用。2. 10mmol/L HCI(AR)溶液。3.3.0mmol/L邻苯三酚溶液称取邻苯三酚0.378g，溶解于10mmol/LHCI中并加至1000ml.4.95%乙醇(AR)、氯仿(AR)、双蒸水/去离子水4℃冰箱预冷或存放。5．501半自动生化分析仪。【操作步骤】1.红细胞SOD粗提液的制备取末梢血(手指或耳垂)或肝素抗凝血50u1,加入装有5ml生理盐水的刻度离心管内，用吸管混匀后30T/min离心5分钟，弃上清。沉淀加入冷的双蒸水0.2ml，使其完全溶血后，加入4℃预冷的95%乙醇0.1ml，振药1~2min，再加入冷氯仿0.1ml，充分振荡1~2min后2000r/min离心5min，上清即为SOD粗提液，记录体积、待测。2．邻苯三酚自氧化率的测定取4支试管，按14-6表操作。表14-6邻苯三酚自氧化率的测定试剂(ml)测定管(U)空白管(B)Tris-HCI缓冲液0.870.87-蒸馏水0.01SOD提取液0.01-3.0mmol/L邻苯三酚溶液0.030.03
15 CuZn-SOD、Mn-SOD 和 Fe-SOD 几类，广泛分布于生物细胞体内，其含量以肝脏最高，其次 为肾脏，红细胞中含量也很高。红细胞中 SOD 属于 CuZn-SOD。体内 SOD 能够特异地催化 超氧化物阴离子发生歧化反应，再由过氧化氢酶转化为 H2O 和 O2，从而消除超氧化物阴离子 的毒性作用。目前测定方法有化学比色法、化学发光法、免疫法、电化学法和电泳法等。 【原理】 邻苯三酚在碱性条件下能迅速发生自氧化，SOD 能抑制邻苯三酚的自氧化反 应。在 420nm 处 0.2mmol/L 邻苯三酚的自氧化速率为 0.060/min，25℃条件下 SOD 作用 4min 后用 HCl 中止反应，根据抑制率高低计算出红细胞 SOD 的活性。 【试剂与器材】 1．Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，含 0.1mol/L Tris、2mmol/L EDTA) 分别取 0.2mol/L Tris 溶 液(含 4mmol/L EDTA)100ml 和 0.2mol/L HCl 溶液 44.76ml，混合后加蒸馏水至 200ml 混匀备 用。 2．10mmol/L HCl(AR)溶液。 3．3.0mmol/L 邻苯三酚溶液 称取邻苯三酚 0.378g，溶解于 10mmol/L HCl 中并加至 1 000ml。 4．95%乙醇(AR)、氯仿(AR)、双蒸水/去离子水 4℃冰箱预冷或存放。 5．501 半自动生化分析仪。 【操作步骤】 1．红细胞 SOD 粗提液的制备 取末梢血(手指或耳垂)或肝素抗凝血 50μl，加入装有 5ml 生理盐水的刻度离心管内，用吸管混匀后 3 000 r/min 离心 5 分钟，弃上清。沉淀加入冷的双 蒸水 0.2ml，使其完全溶血后，加入 4℃预冷的 95%乙醇 0.1ml，振药 1～2min，再加入冷氯 仿 0.1ml，充分振荡 1～2min 后 2 000 r/min 离心 5min，上清即为 SOD 粗提液，记录体积、 待测。 2．邻苯三酚自氧化率的测定 取 4 支试管，按 14-6 表操作。 表 14-6 邻苯三酚自氧化率的测定 试剂(ml) 测定管(U) 空白管(B) Tris-HCl 缓冲液 0.87 0.87 蒸馏水 － 0.01 SOD 提取液 0.01 － 3.0mmol/L 邻苯三酚溶液 0.03 0.03