双向电泳培训实验内容×二.第一向等电聚焦原理及操作*1.原理*在第一向分离中蛋白质先按其等电点（isoelectricpointpI值）分开。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）DFBIORADProteomeWorksSystem
双向电泳培训实验内容 ❖二.第一向等电聚焦原理及操作 ❖1. 原理 ❖在第一向分离中蛋白质先按其等电点 （isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋 白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特 定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技 术称为等电聚焦（IEF）
用oelectricFocuingCarboxylicGroups> Acidic pH R-COO- + H+ => R-COOH>Basic pH R-COOH + OH- => R-COO- + H2O*Amino Groups> Acidic pH R-NH2 + H+ => R-NH3+ Basic pH R-NH3+ + OH- => R-NH2 + H2O6EBIORADProteomeWoRkSSystem
❖Carboxylic Groups ➢Acidic pH R-COO- + H+ => R-COOH ➢Basic pH R-COOH + OH- => R-COO- + H2O ❖Amino Groups ➢Acidic pH R-NH2 + H+ => R-NH3+ ➢Basic pH R-NH3+ + OH- => R-NH2 + H2O Isoelectric Focusing
原理pH34586>910NHNH2NH,NHSNHVHAnodeCathode(+)(-)COOHeCOOHCOOHcOOCOOHCOOHCOO"(0)(-2)(+2)netcharge等电点（isoelectricpoint）：在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象BIORADProteomeWorRKsSyslem
原理 等电点（isoelectric point）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象
The 1st D:Isoelectric FocusingPH3pH10pH7.5Q00000000000000000000000opH3pH7.5pH10000o00000000000000000000PH3pH7.5pH10中中中pH3pH7.5pH10D6BIORADProteomeWorRksSystem
+ – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 The 1st D: Isoelectric Focusing
双向电泳培训实验内容二第一向等电聚焦原理及操作2.操作-----双向电泳上样A.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。B.胶条长度加样体积样品蛋白量7cm:125ul(169ug),11cm:185ul(250ug）,17cm:300ul(405ug)-----考马氏亮蓝R-250染色C.取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温中放置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。D：将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。BIORADProteomeWorRKSystem
双向电泳培训实验内容 ❖ 二.第一向等电聚焦原理及操作 ❖ 2. 操作-双向电泳上样 ❖ A. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽 两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不 要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 ❖ B. 胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm:125 ul(169 ug), 11 cm:185 ul(250 ug), 17 cm:300 ul(405 ug)-考马氏亮蓝R-250染色 ❖ C. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放 置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。 ❖ D．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+） 对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产 生气泡