1.M蛋白血症单克隆球蛋白(M蛋白)血症，主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病以及一些良性M蛋白增多症。在β与球蛋白后区段的各部分出现条致密浓集的M蛋白带。2.蛋白缺乏症主要包括α1抗胰蛋白酶缺乏症、球蛋白缺乏症等。临床上较少见。电泳图型表现为α1或球蛋白部位蛋白缺乏或显著降低。3.肾病见于急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭等。表现为Alb 降低，α2和β升高。4.急慢性炎症表现为α1、α2和β三种球蛋白均增高。5.肝病包括急慢性肝炎和肝硬化。主要表现为AIb降低、β和球蛋白增高，出现β和难分离而相连的“β～桥”，此现象往往是由于IgA增高所致，IgA与肝脏纤维化有关。【注意事项】1.通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以防触电。2.CAM在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻3．缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则通过薄膜时有虹吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。4.电泳常见的缓冲液为巴比妥缓冲液，用硼砂，Tris和EDTA组成的缓冲液可以分离出前白蛋白，三种α-球蛋白，三种β-球蛋白和-球蛋白。5.电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐，最常见的原因有：①点样过多；②点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；③薄膜过湿，样品扩散；④薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；③薄膜与滤纸桥接触不良；③薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行；缓冲液变质；③样品不新鲜；CAM质量不高等。6．染料问题染料的选择应对蛋白质的各组分亲和力相同，吸光度与蛋白质的浓度成正比。并要求水溶性好、染料稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定且易洗脱比色。现在常用丽春红S、氨基黑10B和尼基黑作为染料，其中尼基黑对蛋白质吸光度比氨基黑10B敏感3倍以上。用光密度计扫描定量一般用丽春红S染6
6 1．M 蛋白血症 单克隆γ球蛋白(M 蛋白)血症，主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋 白血症、重链病以及一些良性 M 蛋白增多症。在β与γ球蛋白后区段的各部分出现 一条致密浓集的 M 蛋白带。 2．蛋白缺乏症 主要包括1 抗胰蛋白酶缺乏症、γ球蛋白缺乏症等。临床上较 少见。电泳图型表现为1 或γ球蛋白部位蛋白缺乏或显著降低。 3．肾病 见于急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭等。表现为 Alb 降低，2 和β升高。 4．急慢性炎症 表现为1、2 和β三种球蛋白均增高。 5．肝病 包括急慢性肝炎和肝硬化。主要表现为 Alb 降低、β和γ球蛋白增 高，出现β和γ难分离而相连的“β~γ桥”，此现象往往是由于 IgA 增高所致，IgA 与肝脏纤维化有关。 【注意事项】 1．通电时，不得接触槽内缓冲液或 CAM，以防触电。 2．CAM 在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻。 3．缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则 通过薄膜时有虹吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。 4．电泳常见的缓冲液为巴比妥缓冲液，用硼砂，Tris 和 EDTA 组成的缓冲液可 以分离出前白蛋白，三种-球蛋白，三种β-球蛋白和γ-球蛋白。 5．电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐， 最常见的原因有：①点样过多；②点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；③薄膜 过湿，样品扩散；④薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；⑤薄膜与 滤纸桥接触不良；⑥薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行；⑦缓冲液变质；⑧样 品不新鲜；⑨CAM 质量不高等。 6．染料问题 染料的选择应对蛋白质的各组分亲和力相同，吸光度与蛋白质的 浓度成正比。并要求水溶性好、染料稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳 定且易洗脱比色。现在常用丽春红 S、氨基黑 10B 和尼基黑作为染料，其中尼基黑对 蛋白质吸光度比氨基黑 10B 敏感 3 倍以上。用光密度计扫描定量一般用丽春红 S 染
色，比色法定量既可用丽春红S也可用氨基黑10B染色。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合而氨基黑10B却对白蛋白染色过深导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。7.血清加量标本应新鲜，不得溶血。如为扫描法，丽春红S染色加入血清量在0.5~1.0μ1/cm，氨基黑10B染色加1~1.5u1/cm。如血清总蛋白含量超过80g/L，用氨基黑10B染色时应将血清稀释2倍后加样。若不稀释，白蛋白中蛋白含量太高，区带染色不透，反而出现空泡，甚至蛋白膜脱落在染色液中，致使定量不准确，【评价】1.优点CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷；CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描2.缺点有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大：当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。附：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质【原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍运用于分离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳(disc-electrophoresis)和平板电泳(slab-electrophoresis)。不论圆盘电泳或平板电泳都有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的体系中进行，称为连续PAGE电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液pH值不同、凝胶孔径不同的体系中进行，称为不连续PAGE。不连续PAGE分离中包括三和物理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续PAGE则不具备浓缩效应。本实验介绍不连续聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳【试剂及器材】1.分离胶缓冲液(pH8.9）称取Tris36.3g，1mol/LHCI溶液48ml，加蒸馏水80ml使其溶解，pH调至8.9，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。2.浓缩胶缓冲液(pH6.7）称取Tris5.98g，1mol/LHCI溶液48ml，加蒸馏水至80ml使其溶解，pH调至6.7，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存
7 色，比色法定量既可用丽春红 S 也可用氨基黑 10B 染色。在血清蛋白正常浓度范围 内，丽春红 S 能与各蛋白质组分成正比例结合而氨基黑 10B 却对白蛋白染色过深， 导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。 7．血清加量 标本应新鲜，不得溶血。如为扫描法，丽春红 S 染色加入血清量 在 0.5~1.0μl/cm，氨基黑 10B 染色加 1~1.5μl/cm。如血清总蛋白含量超过 80g/L， 用氨基黑 10B 染色时应将血清稀释 2 倍后加样。若不稀释，白蛋白中蛋白含量太 高，区带染色不透，反而出现空泡，甚至蛋白膜脱落在染色液中，致使定量不准确。 【评价】 1．优点 CAM 电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时 间短，操作简便快捷；CAM 对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易比色定 量，又易透明后进行光密度扫描。 2．缺点 有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大；当电流较大时，薄 膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。 附：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 【原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel el ectrophoresis，PAGE)普遍运用于分 离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳(disc-electrophoresis) 和平板电泳 (slab-electrophoresis)。不论圆盘电泳或平板电泳都有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲 液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的体系中进行，称为连续 PAGE；电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲 液 pH 值不同、凝胶孔径不同的体系中进行，称为不连续 PAGE。不连续 PAGE 分离中包括三种 物理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续 PAGE 则不具备浓缩 效应。本实验介绍不连续聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。 【试剂及器材】 1．分离胶缓冲液(pH8.9) 称取 Tris 36.3g，1mol/L HCl 溶液 48ml，加蒸馏水 80ml 使其溶 解，pH 调至 8.9，用蒸馏水定容至 100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2．浓缩胶缓冲液(pH6.7) 称取 Tris 5.98g，1mol/L HCl 溶液 48ml，加蒸馏水至 80ml 使其 溶解，pH 调至 6.7，用蒸馏水定容至 100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存