充分混匀后，于沸水浴中加热2Omin。自来水冷却后，测定OD心m。以RNA含量为 横坐标，ODom为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的测定 取样品溶液2.5mL,加入地衣酚试剂2.5mL,如前述方法测定OD6m,从标准曲线查 出RNA含量。 五、计算 样品中RNA浓度(gmL)样品测得的RNA(g 2.5(ml) (吕浪需) 实验七三种腺苷酸分离鉴定一醋酸纤维素薄膜电泳法 一、目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离带电颗粒原理：观察核苷酸类物质的紫外吸收现象 二、原理 带申粒子在申场中向若与其自身带相反由荷的电极移动的现象，称为申泳。控制申泳 条件（如pH等），使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷，各组分在电场中移动的速 度或方向各不相同，从而达到分离各组分的目的，这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜 作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维素薄膜电泳法。 在pH4.8电泳缓冲液条件下，带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP解离之后， 带有负电荷量的领序为：ATP>ADP>AMP,它们在电场中移动速度不同，从而得到分离 又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质，将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下 可见暗红色斑点，参照标准样品在同样条件下的电泳情况，对混合试样分离后的各组分进 行鉴定。 21
21 充分混匀后，于沸水浴中加热 20min。自来水冷却后，测定 OD670nm。以 RNA 含量为 横坐标，OD670nm为纵坐标，绘制标准曲线。 2．样品的测定 取样品溶液 2.5mL，加入地衣酚试剂 2.5mL，如前述方法测定 OD670nm，从标准曲线查 出 RNA 含量。 五、计算 样品测得的 RNA（μg） 样品中 RNA 浓度（μg/mL）= 2.5（mL） （吕淑霞） 实验七 三种腺苷酸分离鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳法 一、目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离带电颗粒原理；观察核苷酸类物质的紫外吸收现象。 二、原理 带电粒子在电场中向着与其自身带相反电荷的电极移动的现象，称为电泳。控制电泳 条件（如 pH 等），使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷，各组分在电场中移动的速 度或方向各不相同，从而达到分离各组分的目的，这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜 作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维素薄膜电泳法。 在 pH4.8 电泳缓冲液条件下，带有不同量磷酸基团的 AMP、ADP、ATP 解离之后， 带有负电荷量的顺序为：ATP＞ADP＞AMP，它们在电场中移动速度不同，从而得到分离。 又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质，将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下， 可见暗红色斑点，参照标准样品在同样条件下的电泳情况，对混合试样分离后的各组分进 行鉴定
三、仪器与试剂 1.仪器 (1)电泳仪、电泳槽（平板式） (2)紫外灯 (3)电吹风、医用镊子 (4)醋酸纤维素薄膜(8cm12cm) (5)微量进样器(10μL或50μL) 2.试剂 (1)柠檬酸缓冲液(pH4.8):称取柠檬酸8.4g,柠檬酸钠17.6g,溶于蒸馏水，稀释 到2000mL。 (2)标准腺苷酸溶液：用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成10Omg1OmL溶液。 其中AMP需略加热助溶。置冰箱备用 (3)混合腺苷酸溶液：分别取上述标准液AMP、ADP、ATP各1份等量混匀。置冰 箱备用。 四、操作步骤 1.点样：将醋酸纤维素薄膜放入pH4.8柠檬酸缓冲液中，待膜完全浸透（约0.5h) 后用镊子取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，仔细辨认薄膜无光泽面 用微量进样器在无光洋面上点样。点样点距薄膜一端1.5cm,样点之间距离1.5cm。点样 量为2~3μL,按少量多次原则分2-3次点完。 2.电泳：向两个电泳槽内注入pH4.8的柠檬酸缓冲液，缓冲液的高度约为电泳槽梧深 度的34。（注意：两橹中电冰液面一致）。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋 酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后，将已点样薄膜的无光泽面向下 贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。 点样端置于负极方向，盖上电泳槽盖，接通电源，在电压降为10Vcm的条件下进行 电泳，一小时后关闭电源，取出醋酸纤维素薄膜，用电吹风吹干。 3.鉴定：用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察，用铅笔划出各腺苷酸电泳 斑点，并标明各斑点的腺苷酸代号。 绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱，以标准单核苷酸的迁移率作标准，鉴别试样 中各组分。 五、附注 1.电泳前，一定要检查电极正负极与薄膜方向，确定负极接在薄膜的点样一端，因 为样品是带负电荷，接通电源后，样品要在薄膜上向正极泳动：确定薄膜的无光泽面朝下。 2.点样时，要控制点样点的大小在直径为2-3mm,样点不可太大，否则电泳后观察
22 三、仪器与试剂 1．仪器 （1）电泳仪、电泳槽（平板式） （2）紫外灯 （3）电吹风、医用镊子 （4）醋酸纤维素薄膜（8 cm 12cm） （5）微量进样器（10μL 或 50μL） 2．试剂 （1）柠檬酸缓冲液（pH4.8）：称取柠檬酸 8.4g，柠檬酸钠 17.6g，溶于蒸馏水，稀释 到 2000mL。 （2）标准腺苷酸溶液：用蒸馏水将纯 AMP、ADP、ATP 分别配成 100mg/10mL 溶液。 其中 AMP 需略加热助溶。置冰箱备用。 （3）混合腺苷酸溶液：分别取上述标准液 AMP、ADP、ATP 各 1 份等量混匀。置冰 箱备用。 四、操作步骤 1．点样：将醋酸纤维素薄膜放入 pH4.8 柠檬酸缓冲液中，待膜完全浸透（约 0.5h） 后用镊子取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，仔细辨认薄膜无光泽面， 用微量进样器在无光泽面上点样。点样点距薄膜一端 1.5cm，样点之间距离 1.5cm。点样 量为 2～3μL，按少量多次原则分 2~3 次点完。 2．电泳：向两个电泳槽内注入 pH4.8 的柠檬酸缓冲液，缓冲液的高度约为电泳槽深 度的 3/4。（注意：两槽中电泳液面一致）。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋 酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后，将已点样薄膜的无光泽面向下 贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。 点样端置于负极方向，盖上电泳槽盖，接通电源，在电压降为 10V/cm 的条件下进行 电泳，一小时后关闭电源，取出醋酸纤维素薄膜，用电吹风吹干。 3．鉴定：用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察，用铅笔划出各腺苷酸电泳 斑点，并标明各斑点的腺苷酸代号。 绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱，以标准单核苷酸的迁移率作标准，鉴别试样 中各组分。 五、附 注 1．电泳前，一定要检查电极正负极与薄膜方向，确定负极接在薄膜的点样一端，因 为样品是带负电荷，接通电源后，样品要在薄膜上向正极泳动；确定薄膜的无光泽面朝下。 2．点样时，要控制点样点的大小在直径为 2~3mm，样点不可太大，否则电泳后观察
结果不理想。 六、思考题 1.说明电泳分离腺苷酸的原理。 参考答案 1,电泳法分离的目标物质一定是带电的。腺苷酸是两性物质，其含氮碱基嘌呤与嘧 啶使其具有碱性，而其磷酸基团赋予腺苷酸的酸性。在柠檬酸缓冲液pH4.8条件下，腺苷 酸磷酸基团解离，使腺苷酸带负电，在电场中向正极泳动。AMP、ADP、ATP三种腺苷酸 因磷酸基团的解离而分别带有2、3、4个负电荷，它们在电场中移动速度不同，因此经过 一段时间电泳后，即可达到分离。 (吕淑霞) 实验八植物DNA的提取与测定 一、目的 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量 的植物DNA,用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结 构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握 CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。 二、原理 细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取 DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙 醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中 溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCI溶液为例：RNP在0.l4mol/L NaCI 中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaC浓度逐渐增大时，RNP 的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaC1浓度大于ImoL时，DN 的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4 mol/L NaC1提取DNA。为了得 23
23 结果不理想。 六、思考题 1． 说明电泳分离腺苷酸的原理。 参考答案 1．电泳法分离的目标物质一定是带电的。腺苷酸是两性物质，其含氮碱基嘌呤与嘧 啶使其具有碱性，而其磷酸基团赋予腺苷酸的酸性。在柠檬酸缓冲液 pH4.8 条件下，腺苷 酸磷酸基团解离，使腺苷酸带负电，在电场中向正极泳动。AMP、ADP、ATP 三种腺苷酸 因磷酸基团的解离而分别带有 2、3、4 个负电荷，它们在电场中移动速度不同，因此经过 一段时间电泳后，即可达到分离。 （吕淑霞） 实验八 植物 DNA的提取与测定 一、目的 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量 的植物 DNA，用于构建基因文库、基因组 southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结 构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定 DNA 的原理并掌握 CTAB 提取 DNA 的方法，进一步了解 DNA 的性质。 二、原理 细胞中的 DNA 绝大多数以 DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取 DNA 时，一般先破碎细胞释放出 DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙 醇把 DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中 溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以 NaCl 溶液为例：RNP 在 0.14mol/L NaCl 中溶解度很大，而 DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的 1％。当 NaCl 浓度逐渐增大时，RNP 的溶解度变化不大，而 DNP 的溶解则随之不断增加。当 NaCl 浓度大于 1mol/L 时，DNP 的溶解度最大，为纯水中溶解度的 2 倍，因此通常可用 1.4mol/L NaCl 提取 DNA。为了得
到纯的DNA制品，可用适量的RNas处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。 关于植物总DNA的提取主要有两种方法： I.CTAB法： CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，bromide,简称CTAB) 是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mo/L NaCI)是可溶的.当降低溶液盐的浓度到一定程度(03 nol/L NaC1)时从溶液中沉淀，通 过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复 合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 2.SDS法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate,简称SDS) 使DNA与蛋白质分离，在高温(55~65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除 去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 一般生物体的基因组DNA为10、10bD.在基因克降工作中，桶常要求制备的大分子 DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为 平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有 效制各大分子DNA的方法必须考虑两个原则：(I)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物 质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNsc对DNA的降解。(2) 尽量减少对溶液中DNA的机减剪切破坏。 几乎所有的DNase都需要Mg2或M2为辅因子，故实现(I)尽量去除蛋白质的要 求，需加入一定浓度的整合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进 行（一般利用液氮或冰浴）。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的 涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。 提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、 “熔点”(melting temperature,Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用 CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料 新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2.主要仪器 (1)高速冷冻离心机 (2)751型分光光度计 (3)恒温水浴 (3)液氮或冰浴设备
24 到纯的 DNA 制品，可用适量的 RNase 处理提取液，以降解 DNA 中搀杂的 RNA。 关于植物总 DNA 的提取主要有两种方法： 1． CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称 CTAB）： 是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通 过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将 CTAB 与核酸的复 合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2． SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称 SDS） 使 DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除 去沉淀，上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 一般生物体的基因组 DNA 为 10 7 ~10 9 bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子 DNA 的分子量为克隆片段长度的 4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为 平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有 效制备大分子 DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物 质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源 DNase 对 DNA 的降解。（2） 尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的 DNase 都需要 Mg 2+或 Mn 2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要 求，需加入一定浓度的螯合剂，如 EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进 行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在 DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的 涡旋，而且动作要轻柔，在进行 DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。 提取的 DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、 “熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用 CTAB 法提取 DNA 并通过紫外吸收法鉴定。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2．主要仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）751 型分光光度计 （3）恒温水浴 （3）液氮或冰浴设备
(4)磨口锥形瓶 (5)核酸电泳设备 3.试剂(CTAB法) (1)CTAB提取缓冲液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0),20 mmol/LEDTA-Na2,1.4molM NaCI(如表1)，2%CTAB,使用前加入0.1%(VW)的B-巯基乙醇。 表1CTAB提取缓冲液配制 试剂名称 M.W. 配制1000ml 配制500mL Tris 121.14 12.114g 6.057e EDTA-Nas 37224 7.4448g 372240 58.4 81.816g 40.908g ·用HC调pH值。 (2)TE缓冲液：10mmol/LTris-HCL,ImM EDTA(pH8.0)。 (3)DNase-free RNase A:溶解RNase A于TE缓冲液中，浓度为10mg/mL,煮沸 10~30min,除去DNase活性，一20C贮存(DNase为DNA醇，Rnase为RNA酶)。 (4)氯仿-异戊醇混合液(24：1，VN):240mL氯仿(A.R)加10mL异戊醇(A.R) 混匀。 (5)3molL乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取NaAc3H,081.62g,用蒸馏水溶解，配 制成200mL,用HAc调pH至6.5。 (6)95%乙醇 TE缓冲液，Tis-HCI(pH8.O)液，NaAc溶液均需要高压灭菌 四、操作步骤 1.称取2~5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后 冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1©m长，置研体中，经液氨冷冻后研磨 成粉末。待液氮燕发完后，加入15mL预热(60~65C)的CTAB提取缓冲液，转入一磨 口锥形瓶中，置于65℃水浴保温，0.5-1h,不时地轻轻摇动混匀。 2.加等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。 3.将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4000min离心5min,静置，离心管 中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋 白以及下层的氯仿。 4。根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。 5.收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1~2倍体积预冷的95%乙 醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA)迅速缠绕在 玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加1~2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙 25
25 （4）磨口锥形瓶 （5）核酸电泳设备 3．试剂（CTAB 法） （1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/L NaCl（如表 1），2% CTAB，使用前加入 0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。 表 1 CTAB提取缓冲液配制 * 用 HCl 调 pH 值。 （2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。 （3） DNase-free RNase A: 溶解 RNase A 于 TE 缓冲液中，浓度为 10mg/mL，煮沸 10～30min, 除去 DNase 活性，－20℃贮存（DNase 为 DNA 酶，Rnase 为 RNA 酶）。 （4）氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：240mL 氯仿（A.R.）加 10mL 异戊醇（A.R.） 混匀。 （5）3mol/L 乙酸钠（NaAc，pH6.8）：称取 NaAc 3H2O 81.62g，用蒸馏水溶解，配 制成 200mL，用 HAc 调 pH 至 6.5。 （6）95％乙醇 TE 缓冲液，Tris-HCl（pH8.0）液，NaAc 溶液均需要高压灭菌。 四、操作步骤 1． 称取 2～5g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后 冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成 1cm 长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨 成粉末。待液氮蒸发完后，加入 15mL 预热（60～65℃）的 CTAB 提取缓冲液，转入一磨 口锥形瓶中，置于 65℃水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。 2．加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。 3．将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下 4 000r/min 离心 5min，静置，离心管 中出现 3 层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋 白以及下层的氯仿。 4．根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。 5．收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入 1～2 倍体积预冷的 95％乙 醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为 DNA）迅速缠绕在 玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加 1～2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙 试剂*名称 M.W. 配制 1 000mL 配制 500mL Tris 121.14 12.114g 6.057g EDTA-Na2 372.24 7.4448g 3.7224g NaCl 58.44 81.816g 40.908g