核酸 实验五酵母RNA的提制 一、目的： 学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识。 二、原理： 提取和制各RNA的首要问题是选RNA含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸 的原科，其中RNA的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA(2.67~10.0%), DNA很少(0.03一O.516%),而且菌体容易收集，RNA也易于分离。此外，抽提后的菌体 蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。 RNA提制过程首先要使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。 再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0~2.5，使RNA沉淀，进行离心 收集。然后运用RNA不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA沉淀。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁 在稀碱条件下溶解，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在稀碱条件下不稳 定，容易被碱分解：浓盐法是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的诱性，使 RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。使用浓盐法提出RNA时应注意掌握温度 避免在20一0℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围， 会使RNA因降解而降低提取率。在90~100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯 南和磷酸单酯酶，有利于RNA的提取。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料 活性干酵母：pH0.5~50的精密试纸：冰块。 2.仪器 (1)药物天平 (2)三角瓶(100mL) (3)量筒(50mL) (4)水浴锅 (5)由拉 (6)试管木夹 16
16 核 酸 实验五 酵母 RNA的提制 一、目的： 学习和掌握从酵母中提制 RNA 的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识。 二、原理： 提取和制备 RNA 的首要问题是选 RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸 的原料，其中 RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是 RNA（2.67～10.0%）， DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌体 蛋白质（占干菌体的 50%）仍具有很高的应用价值。 RNA 提制过程首先要使 RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。 再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将 pH 调至 2.0～2.5，使 RNA 沉淀，进行离心 收集。然后运用 RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤 RNA 沉淀。 提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁 在稀碱条件下溶解，使 RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但 RNA 在稀碱条件下不稳 定，容易被碱分解；浓盐法是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使 RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。使用浓盐法提出 RNA 时应注意掌握温度， 避免在 20～70℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围， 会使 RNA 因降解而降低提取率。在 90～100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯 酶和磷酸单酯酶，有利于 RNA 的提取。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 活性干酵母；pH0.5～5.0 的精密试纸；冰块。 2．仪器 （1）药物天平 （2）三角瓶（100mL） （3）量筒（50mL） （4）水浴锅 （5）电炉 （6）试管木夹
(7)离心管 (8)离心机(4000rmin (9)烧杯(250mL,50mL.10mL) (10)滴管及玻棒 (11)吸滤瓶(500mL) (12)布氏漏斗(60mm) (13)表面皿(8cm (14)烘箱 (15)干操器 (16)紫外可见分光光度计 3.试剂 (1)NaCI(化学纯) (2)6mol/L HCI (3)95%乙醇（化学纯） 四、操作步骤 1.提取 活性干酵母粉5g,倒入100mL三角瓶中，加NaC15g,水50mL,搅拌均匀，置于沸 水浴中提取1h。 2.分离 将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大离心管内，以3500rmin离心10min, 使提取液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯中，并置于放有冰块的250mL烧杯中冷却，待冷 至10℃以下时，用6 mol/L HCI小心地调节pH至2.0~2.5。随着pH下降，溶液中白色沉 淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置1Omim 使沉淀充分，颗粒变大。 4.抽滤和洗涤 上述悬浮液以3000r/min离心10min,得到RNA沉淀，将沉淀物放在10mL小烧杯内， 用95%的乙醇5~I0mL充分搅拌洗涤，然后在铺有己称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵抽 气过滤，再用95%乙醇5一I0mL淋洗3次。由于RNA不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使 沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯 度。 5.干燥 从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在8cm表面皿上，置于80℃烘箱内干燥。将 17
17 （7）离心管 （8）离心机（4 000r/min） （9）烧杯（250mL, 50mL, 10mL） （10）滴管及玻棒 （11）吸滤瓶（500mL） （12）布氏漏斗（60mm） （13）表面皿（8cm） （14）烘箱 （15）干燥器 （16）紫外可见分光光度计 3．试剂 （1）NaCl（化学纯） （2）6mol/L HCl （3）95％乙醇（化学纯） 四、操作步骤 1．提取 活性干酵母粉 5g，倒入 100mL 三角瓶中，加 NaCl 5g，水 50mL，搅拌均匀，置于沸 水浴中提取 1h。 2．分离 将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大离心管内，以 3 500r/min 离心 10min， 使提取液与菌体残渣等分离。 3．沉淀 RNA 将离心得到的上清液倾于 50mL 烧杯中，并置于放有冰块的 250mL 烧杯中冷却，待冷 至 10℃以下时，用 6mol/L HCl 小心地调节 pH 至 2.0～2.5。随着 pH 下降，溶液中白色沉 淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制 pH）。调好后继续于冰水中静置 10min， 使沉淀充分，颗粒变大。 4．抽滤和洗涤 上述悬浮液以 3 000r/min 离心 10min，得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10mL 小烧杯内， 用 95％的乙醇 5～10mL 充分搅拌洗涤，然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵抽 气过滤，再用 95％乙醇 5～10mL 淋洗 3 次。由于 RNA 不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使 沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯 度。 5．干燥 从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在 8cm 表面皿上，置于 80℃烘箱内干燥。将
干操后的RNA制品称重 6.含量测定 称取一定量干燥后的RNA产品配制成浓度为10一50μgmL的溶液，在751型分光光 度计上测定其26Onm处的光密度值，按下式计算RNA含量： RNA含量(%)= RNA溶液总体积(mL) 100 0.024L. RNA称取量(ug) 式中：OD2m为260nm处的光密度值：L为此色杯的光径(cm):0.024为1mL溶液含有 1μgRNA的光密度值。 五、结果计算 根据含量测定的结果按下式计算提取率： RNA提取率(6)=RNA含量)RNA制品量IO 酵母重(g) 六、思考题 1.RNA提制中注意事项是什么？ 参考答案 1.主要注意事项为：避开核酸酶作用的温度范围20~70℃，防止RNA降解。同时 在调pH值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。此外，在抽滤洗涤时，要用乙醇汾 涤，且不可用水洗，否则将导致RNA部分溶解而造成损失，降低RNA提取率。 附注：苯酚法提取酵母RNA (一·)原理 细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA 时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(Sodium dodeeyl sulfate SDS)的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚 相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层 本实验采用的0.15olL缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合 物只有极少部分解离：用酚处理时DNA蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去， 这样得到的RNA制品中混杂的DNA极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA制品，可进一步 除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA不仅 纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。 (二)主要仪器和试剂 18
18 干燥后的 RNA 制品称重。 6．含量测定 称取一定量干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 10～50μg/mL 的溶液，在 751 型分光光 度计上测定其 260nm 处的光密度值，按下式计算 RNA 含量： OD260nm RNA 溶液总体积（mL） RNA 含量（%）= 0.024 L RNA 称取量（μg） 100 式中：OD260nm 为 260nm 处的光密度值；L 为比色杯的光径（cm）；0.024 为 1mL 溶液含有 1μg RNA 的光密度值。 五、结果计算 根据含量测定的结果按下式计算提取率： RNA 含量（%） RNA 制品量 RNA 提取率（%）= 酵母重（g） 100 六、思考题 1．RNA 提制中注意事项是什么？ 参考答案 1．主要注意事项为：避开核酸酶作用的温度范围 20～70℃，防止 RNA 降解。同时 在调 pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。此外，在抽滤洗涤时，要用乙醇洗 涤，且不可用水洗，否则将导致 RNA 部分溶解而造成损失，降低 RNA 提取率。 附 注：苯酚法提取酵母 RNA （一）原理 细胞内大部分 RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取 RNA 时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚 相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。 本实验采用的 0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分 RNA-蛋白复合物解离，而 DNA-蛋白复合 物只有极少部分解离；用酚处理时 DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去， 这样得到的 RNA 制品中混杂的 DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理 RNA 制品，可进一步 除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使 RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的 RNA 不仅 纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。 （二）主要仪器和试剂
1.仪器 (1)台式高速离心机(10000rmin (2)水浴 (3)Eppendorf (1.5mL) (4)紫外可见分光光度计 (5)冰箱或冷柜(0~4℃) (6)振荡器 (7)分析天平（精确至0.1mg) (8)真空干操器 2.试剂（均为分析纯 (1)SDS-缓冲液：0.3%SDS,0.1mol/L NaCI,0.05molL乙酸钠，用乙酸调到pH5.0. (2)饱和酚液：重蒸苯酚用(1)溶液饱和。 (3)氯仿-异戊醇液：24：1(VN)。 (4)含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 (5)无水乙醇 (6)乙醚 (7)溶菌酶(B.R)(1mgmL) (三)操作步骤 1.取lg活性干酵母在研体中研碎，加10 mLSDS-.缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf 管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL,混匀，室温静置10min,再加等体积饱和酚 液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0~4℃低温环境下，10000rmin离心10min。 吸出上层清液，转入新的Eppendorf管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min, 然后10000rmin离心5mim。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管，加2倍体积95% 乙醇（含2%乙酸钾），在冰浴中放置30min,使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min, 弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1mi,保 留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。 RNA制品纯度的测定及RNA提取率的计算与浓盐法相同。 (吕淑霞) 19
19 1．仪器 （1）台式高速离心机（10 000r/min） （2）水浴 （3）Eppendorf 管（1.5mL） （4）紫外可见分光光度计 （5）冰箱或冷柜（0～4℃） （6）振荡器 （7）分析天平（精确至 0.1mg） （8）真空干燥器 2．试剂（均为分析纯） （1）SDS-缓冲液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到 pH5.0。 （2）饱和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液饱和。 （3）氯仿-异戊醇液：24﹕1（V/V）。 （4）含 2％乙酸钾的 95％乙醇溶液。 （5）无水乙醇 （6）乙醚 （7）溶菌酶（B.R.）（1mg/mL） （三）操作步骤 1．取 1g 活性干酵母在研钵中研碎，加 10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各 Eppendorf 管（略少于管容积的一半），加溶菌酶 0.1mL，混匀，室温静置 10min，再加等体积饱和酚 液，室温下剧烈振荡 5min。置冰浴中分层，在 0～4℃低温环境下，10 000r/min 离心 10min。 吸出上层清液，转入新的 Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡 2.5min， 然后 10 000r/min 离心 5min。吸出上层清液，转入另一新 Eppendorf 管，加 2 倍体积 95％ 乙醇（含 2％乙酸钾），在冰浴中放置 30min，使 RNA 沉淀。再以 10 000r/min 离心 5min， 弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各 1min，保 留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。 RNA 制品纯度的测定及 RNA 提取率的计算与浓盐法相同。 （吕淑霞）
实验六地衣酚显色法测定RNA含量 一、目的 学习RNA含量的定量测定方法以及RNA快速定性检测方法，熟悉分光光度计使用原 理及其操作。 二、原理 在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3,5二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质， 其最大光吸收值在670nm处。要说明的是：地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均可与地衣酚 反应，DNA及其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时，要考虑DNA等杂质影 响，可先测定DNA含量，再计算出RNA含量。 三、实验材料、主要仪器与试剂 1.实验材料 (I)RNA标准溶液：取标准RNA(预先经定磷法确定其纯度)配成1O0μgmL的 溶液。 (2)样品待测液：适当稀释，使RNA含量为50一IO0μgmL 2.地衣酚试剂 先称取100mg三氯化铁溶于100mL浓盐酸中（配制0.1%浓度的溶剂）备用。在使用 前加入100mg地衣酚配制成0.1%浓度的地衣酚试剂 3.主要仪器 (1)分光光度计。 四、操作方法 1.标准RNA曲线的制作 取12支洁净干燥试管按下表取样并加入试剂 管号 RNA标准溶液(mL) 0(mL)地衣酚试剂(mL) RNA含量(g) 1,2 0 25 25 0 3.4 2.0 5,6 1.0 1.5 2.5 100 7,8 1.5 1.0 150 9,10 2.0 0.5 2.5 200 山，12 25 0 25 250 20
20 实验六 地衣酚显色法测定 RNA 含量 一、目的 学习 RNA 含量的定量测定方法以及 RNA 快速定性检测方法，熟悉分光光度计使用原 理及其操作。 二、原理 在三氯化铁及盐酸存在下，RNA 与 3,5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质， 其最大光吸收值在 670nm 处。要说明的是：地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均可与地衣酚 反应，DNA 及其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定 RNA 时，要考虑 DNA 等杂质影 响，可先测定 DNA 含量，再计算出 RNA 含量。 三、实验材料、主要仪器与试剂 1．实验材料 （1）RNA 标准溶液：取标准 RNA（预先经定磷法确定其纯度）配成 100μg/mL 的 溶液。 （2）样品待测液：适当稀释，使 RNA 含量为 50～100μg/mL。 2．地衣酚试剂 先称取 100mg 三氯化铁溶于 100mL 浓盐酸中（配制 0.1%浓度的溶剂）备用。在使用 前加入 100mg 地衣酚配制成 0.1%浓度的地衣酚试剂。 3．主要仪器 （1）分光光度计。 四、操作方法 1． 标准 RNA 曲线的制作 取 12 支洁净干燥试管按下表取样并加入试剂： 管号 RNA 标准溶液（mL） H2O（mL） 地衣酚试剂（mL） RNA 含量（μg） 1，2 0 2.5 2.5 0 3，4 0.5 2.0 2.5 50 5，6 1. 0 1.5 2.5 100 7，8 1.5 1. 0 2.5 150 9，10 2.0 0.5 2.5 200 11，12 2.5 0 2.5 250