醇，即为DNA粗制品。 6.上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA,可将粗 制品溶于T正缓冲液中，加入1 Dmg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50μgmL,混合物 于37C水浴中保温30min除去RNA。重复步骤2~5的操作，可制得较纯的DNA制品 7.将DNA制品溶于250uL的TE缓冲液中，完全溶解DNA样品。 8.加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH6.8)和2倍体积的95%乙醇，沉淀DNA, 重复步骤5。最后，将DNA溶于2S0μL的TE缓冲液中。 9.在751型分光光度计上测定该溶液在260m紫外光波长下的光密度值。代入下式 计算DNA的含量。 四、结果计算 DNA浓度(g/mL).=OD 0.020L 稀释倍数 式中OD2m为260nm处的光密度：L为比色杯光径(cm):0.020为1 g/mL DNA钠盐 的光密度。 DNA的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为 280nm。上述DNA溶液适当稀释后，在751分光光度计上测定其OD26m、OD2mm和 ODm如OD2s/OD2m≥2，OD2a/OD2am≥1.8，表示RNA已经除净，蛋白含量 不超过0.3%。 五、附注 如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到4%(WW)。在许多 情况下，使用0.1%(VN)巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧 化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%(VN),则会 大大降低DNA的得率。 六、思考题 1.制备的DNA在什么溶液中较稳定？ 2.为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？ 参考答案 L.制备的DNA在：(I)含有螯和剂如EDTA中较稳定，因为EDTA能整和Mg或 Mn离子，抑制DNas:(2)在pH5~9之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA的结构： (3)有一定离子强度（强度越高，DNA越稳定）的溶液中较稳定。 36
26 醇，即为 DNA 粗制品。 6．上述 DNA 粗制品含有一定量的 RNA 和其它杂质。若要制取较纯的 DNA，可将粗 制品溶于 TE 缓冲液中，加入 10mg/mL 的 RNase 溶液，使其终浓度达 50μg/mL，混合物 于 37℃水浴中保温 30min 除去 RNA。重复步骤 2～5 的操作，可制得较纯的 DNA 制品。 7．将 DNA 制品溶于 250μL 的 TE 缓冲液中，完全溶解 DNA 样品。 8．加入 1/10 倍体积的 3mol/L NaAc（pH6.8）和 2 倍体积的 95％乙醇，沉淀 DNA， 重复步骤 5。最后，将 DNA 溶于 250μL 的 TE 缓冲液中。 9．在 751 型分光光度计上测定该溶液在 260nm 紫外光波长下的光密度值。代入下式 计算 DNA 的含量。 四、结果计算 OD260nm DNA 浓度（μg/mL）＝ 0.020 L 稀释倍数 式中 OD260nm为 260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为 1μg/mL DNA 钠盐 的光密度。 DNA 的紫外吸收高峰为 260nm，吸收低峰为 230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为 280nm。上述 DNA 溶液适当稀释后，在 751 分光光度计上测定其 OD260nm、OD230nm 和 OD280nm。如 OD260nm/ OD230nm≥2，OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示 RNA 已经除净，蛋白含量 不超过 0.3％。 五、附 注 如果植物样品不经液氮处理，提取液中的 CTAB 浓度需要提高到 4%（W/V）。在许多 情况下，使用 0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧 化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于 0.1%（V/V），则会 大大降低 DNA 的得率。 六、思考题 1．制备的 DNA 在什么溶液中较稳定? 2．为了保证植物 DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？ 参考答案 1．制备的 DNA 在：（1）含有螯和剂如 EDTA 中较稳定，因为 EDTA 能螯和 Mg 2+或 Mn 2+离子，抑制 DNase；（2）在 pH5～9 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏 DNA 的结构； （3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定
(TE满足以上要求，但如需对所得DNA进行酶切，EDTA浓度不可过高，一般用O.I TE或0.2TE)。 2,为了保证植物DNA的完整性：(1)整个提取村程应在较低温度下讲行（一般利用 液氮或冰浴)：这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解：(2)当DNA处于溶解状态 时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔：在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸 管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 (钟鸣) 实验九质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、目的 掌握质粒的小量快速提取法：了解质粒酶切鉴定原理。 二、原理 质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间，具有双链闭 合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和 转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游 离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许 多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增：收集和裂解 细南：分离和纯化质粒DNA。采用溶南酶可破坏南体细胞壁，十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,.SDS)可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后，细菌 DNA缠绕附者在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用 酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA分子量一般在1O~10'道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处 或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环D八A(op circular DNA,简称ocDNA)。在电泳时，同一质粒如以cceDNA形式存在，它比其开环和 27
27 （TE 满足以上要求, 但如需对所得 DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用 0.1 TE 或 0.2 TE）。 2．为了保证植物 DNA 的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用 液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源 DNase 对 DNA 的降解；（2）当 DNA 处于溶解状态 时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行 DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸 管，尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。 （钟鸣） 实验九 质粒 DNA的提取、酶切与鉴定 一、目的 掌握质粒的小量快速提取法；了解质粒酶切鉴定原理。 二、原理 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在 1~200kb 之间，具有双链闭 合环状结构的 DNA 分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和 转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游 离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许 多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。 所有分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解 细菌；分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在上清液中。用 酒精沉淀洗涤，可得到质粒 DNA。 质粒 DNA 分子量一般在 10 6 ~10 7道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处 或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环 DNA（open circular DNA, 简称 ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和
线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带】 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异 核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和 顺序DNA片段。如：EcoR I和Hnd的识别序列和切口是： EcoR I:GAATTC HindllI:A↓AGCTT G,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示醇切口。限制性内切对环状质粒DNA 有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此签定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可 以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用己知分子量 的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA 的分子量。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.主要仪器 (1)塑料离心管1.5mL30 (2)塑料离心管架1 (3)微量加样器10uL、100uL、1000μL各一支 (4)常用玻璃仪器及滴管等 (5)台式高速离心机(20000min) (6)电泳仪 (7)电泳槽 (8)样品桔模板 2.材料 大肠杆菌DH5a 3。试剂 (1)plH8.0GE.T缓冲液(50 nmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA,25 nmol/L Tris-lHCI): 用前加溶菌酶4mgmL。 (2)pH4.8乙酸钾溶液(60mL5 mol/LKAc,11.5mL冰乙酸，28.5mLH,0 (3)粉/氯仿(1：1，VV):酚需在160℃茧蒸，加入抗氧化剂8-经基隆琳，使其衣 度为0.1%，并用Ts-HC1缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇(24：1， V/W). (4)pH8.OTE缓冲液：I0 nmol/L Tris,1mmol/L EDTA,其中含有RNA醇(RNase) 20μgmL。 (S)TBE缓冲液：称取Ts10.88g、硼酸5.52g和EDTA0.72g,用蒸馏水溶解后 定容至200mL,用前稀释10倍。 28
28 线状 DNA 的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒 DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带。 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA 分子上的特异 核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 的双链，形成一定长度和 顺序 DNA 片段。如：EcoRⅠ和 HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT G，A 等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可 以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量 的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知 DNA 的分子量。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．主要仪器 （1）塑料离心管 1.5mL 30 （2）塑料离心管架 1 （3）微量加样器 10μL、100μL、1 000μL 各一支 （4）常用玻璃仪器及滴管等 （5）台式高速离心机（20 000r/min） （6）电泳仪 （7）电泳槽 （8）样品槽模板 2．材料 大肠杆菌 DH5α 3．试剂 （1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）； 用前加溶菌酶 4mg/mL。 （2）pH 4.8 乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰乙酸，28.5mL H2O） （3）酚/氯仿（1∶1，V/V）：酚需在 160℃重蒸，加入抗氧化剂 8-羟基喹啉，使其浓 度为 0.1%，并用 Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1， V/V）。 （4）pH 8.0 TE 缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有 RNA 酶（RNase） 20μg/mL。 （5）TBE 缓冲液：称取 Tris10.88g、硼酸 5.52g 和 EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后， 定容至 200mL，用前稀释 10 倍
(6)EB染色液：称取Sg溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB),溶于蒸馏水中并定容 到10mL,避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍，使其最终浓度达到0.5μgmL。 四、操作步骤 1.培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌DH5a接种在LB琼脂培养基上，37℃培养2448h。 2.从细菌中快速提取制备质粒DNA (1)用35根牙签挑取平板培养基上的菌落，放入1.5mL小离心管中，或取液体培 养菌液1.5mL置小离心管中，10000rmin离心1min去掉上清液。加入150μL的GE.T 缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min (2)加入200μL新配置的0.2 mol/L NaOH,1%SDS。加盖，颠倒2-3次使之混匀。 冰上放置5min。 (3)加150μL冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置15min.10000rmi 离心5min,上清液倒入另一离心管中。 (4)向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，10000rmin离心2min,将上清液 转移至新的离心管中。 (S)向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2min。离心5mim,倒去上 清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 (6)加1L70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干，待用。 3.质粒DNA的酶解 将自提质粒加入20μL的TE缓冲液，使DNA完全溶解。取清洁、干燥、灭南的具 塞离心管编号用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个小离心管内。 表1DWA酶切加样表 管号标准样品标准样品 自提样品质内切南EcoRIEcoRI酶切缓冲水(uL) A DNA()PBR322(g)(L) 液10（μL) 10 2、 8 10 4 2 0.5 2 7 10 2 8 ·补无双蒸水至20L,依实际情况做相应调整 29
29 （6）EB 染色液：称取 5g 溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB），溶于蒸馏水中并定容 到 10mL，避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释 1 000 倍，使其最终浓度达到 0.5μg/mL。 四、操作步骤 1．培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌 DH5α接种在 LB 琼脂培养基上，37℃培养 24~48h。 2．从细菌中快速提取制备质粒 DNA （1）用 3~5 根牙签挑取平板培养基上的菌落，放入 1.5mL 小离心管中，或取液体培 养菌液 1.5 mL 置小离心管中，10 000r/min 离心 1min 去掉上清液。加入 150μL 的 G.E.T. 缓冲液，充分混匀，在室温下放置 10min。 （2）加入 200μL 新配置的 0.2mol/L NaOH，1%SDS。加盖，颠倒 2 ~ 3 次使之混匀。 冰上放置 5 min。 （3）加 150μL冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置 15 min。10 000r/min 离心 5 min，上清液倒入另一离心管中。 （4）向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min 离心 2 min，将上清液 转移至新的离心管中。 （5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置 2 min。离心 5 min，倒去上 清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （6）加 1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干，待用。 3． 质粒 DNA 的酶解 将自提质粒加入 20μL 的 TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解。取清洁、干燥、灭菌的具 塞离心管编号用微量加样器按表 1 所示将各种试剂分别加入每个小离心管内。 表 1 DNA酶切加样表 管 号 标准样品 λDNA(μg) 标准样品 PBR322(μg) 自提样品质 粒(μL) 内切酶 EcoRI (μ) EcoRI 酶切缓冲 液 10 (μL) 水 * (μL) 1 10 2 8 2 10 4 2 3 0.5 2 4 1 4 2 5 0.5 4 2 6 10 4 2 8 7 10 2 8 *补无菌双蒸水至 20μL，依实际情况做相应调整
加样后，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解2~3h,反应终止后，各酶切样品于冰箱 中贮存备用。 4.DNA琼脂糖凝胶电泳 (1)琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 mLTBE缓冲液， 经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为12%的琼脂糖凝胶。 (2)胶板的制备：取橡皮膏（宽约1cm)将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将 样品槽板垂直立在玻璃板表面。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使 胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30m,待凝固完全 后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。用滴管将样品槽内注满TBE 缓冲液以防止干裂，制各好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。 (3)加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样 品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。 5.电泳 加完样品后的凝胶板，立即诵电。样品讲胶前.应使电流控制在20mA,样品讲胶后 电压控制在60-80V,电流为40-50mA。当指示前沿移动至距离胶板1-2cm处，停止电泳 6.垫色 将电泳后的胶板在EB染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。 五、结果与观察 在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出红色的荧 光条带 六、思考题 L.染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？ 2.EB染料有哪些特点？在使用时应注意些什么？ 参考答案 I,纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA 被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、藏处理DNA溶液时 线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其 天然构象。 2.EB染料的全名是3,8.二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐。EB能插入DNA分子中碱基 对之间，导致EB与DNA结合，DNA所吸收的26Onm的紫外光传递给EB,或者结合的 EB本身在300nm和360nm吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以560nm波长发射出来。 EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，室温下染色1520mim:不会使核酸断裂 30
30 加样后，小心混匀，置于 37℃水浴中，酶解 2~3h，反应终止后，各酶切样品于冰箱 中贮存备用。 4．DNA 琼脂糖凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶的制备：称取 0.6g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 50 mL TBE 缓冲液， 经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为 1.2%的琼脂糖凝胶。 （2）胶板的制备：取橡皮膏（宽约 1cm）将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将 样品槽板垂直立在玻璃板表面。将冷却至 65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使 胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置 30 min，待凝固完全 后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。用滴管将样品槽内注满 TBE 缓冲液以防止干裂，制备好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。 （3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样 品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。 5． 电泳 加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在 20mA，样品进胶后 电压控制在 60~80V，电流为 40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板 1~2cm 处，停止电泳。 6． 染色 将电泳后的胶板在 EB 染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。 五、结果与观察 在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出红色的荧 光条带。 六、思考题 1．染色体 DNA 与质粒 DNA 分离的主要依据是什么？ 2．EB 染料有哪些特点？在使用时应注意些什么？ 参考答案 1． 纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA 被断裂成线状分子，但质粒 DNA 为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理 DNA 溶液时， 线状染色体 DNA 容易发生变性，共价闭环的质粒 DNA 在冷却和回到中性 pH 时即恢复其 天然构象。 2．EB 染料的全名是 3,8-二氨基-5-乙基-6 苯基菲啶溴盐。EB 能插入 DNA 分子中碱基 对之间，导致 EB 与 DNA 结合，DNA 所吸收的 260nm 的紫外光传递给 EB，或者结合的 EB 本身在 300nm 和 360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以 560 nm 波长发射出来。 EB 染料有许多优点，如染色操作简便、快速，室温下染色 15~20min；不会使核酸断裂；