【注意事项】 1.尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2.研磨过程中确保样品不要融化，直至加CTAB 3.酚氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4.所用试剂需灭南。 5.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7.电泳时应注意电源线路，预防触电。 8.溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实 验室内使用。 9.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 1O.DNA带形状模糊：DNA加样过多：电压太高：凝胶中有气泡。 1L.紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除苯 酚、RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往 比实际浓度偏高。 12.测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破：持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1.提取DNA之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2.提取DNA的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3.如何检测、评价提取的DNA的质量？ 4.如何确定提取的DNA的浓度？ 5.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 6.CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7.电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8.如何配制电泳缓冲液TBE? 9.试分析自己实验得到的电冰结果？ 10.EB染色的特点和注意事项是什么？ 11.上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12.DNA定最时，什么方法比较精确？ 13.紫外分光光度法测定DNA浓度的原理？ 14.DNA样品的A260/A280比值如何反应DNA的纯度 15.DNA样品的A260/A280比值大于20或小于1.8时应该如何处理才能提高DNA纯度？
【注意事项】 1．尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA 可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2．研磨过程中确保样品不要融化，直至加 CTAB 3．酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4．所用试剂需灭菌。 5．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7．电泳时应注意电源线路，预防触电。 8．溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实 验室内使用。 9．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 10．DNA 带形状模糊：DNA 加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 11．紫外分光光度法不能区分 DNA 分子的构型，如质粒 DNA 分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体 DNA 和 RNA 等。由于测定吸收光度 A260 时，难以排除苯 酚、RNA、染色体 DNA、以及 DNA 解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往 比实际浓度偏高。 12．测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破；持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1. 提取 DNA 之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2. 提取 DNA 的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3. 如何检测、评价提取的 DNA 的质量？ 4. 如何确定提取的 DNA 的浓度？ 5. 分离基因组 DNA 和质粒 DNA 有哪些不同之处？ 6. CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7. 电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8. 如何配制电泳缓冲液 TBE？ 9. 试分析自己实验得到的电泳结果？ 10. EB 染色的特点和注意事项是什么？ 11. 上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12. DNA 定量时，什么方法比较精确？ 13. 紫外分光光度法测定 DNA 浓度的原理？ 14. DNA 样品的 A260/A280 比值如何反应 DNA 的纯度？ 15. DNA 样品的 A260/A280 比值大于 2.0 或小于 1.8 时应该如何处理才能提高 DNA 纯度？
实验二PCR扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术及DNA片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合醇链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2”倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个 扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段：②退火，快速降低温度至50-60C后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段：③延伸，溶液反应温度升至T2C,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP,按5”一3方向复制出互 补DNA,即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可 扩增1O51O'倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理：
实验二 PCR 扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术及 DNA 片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个 扩增过程分三步：① 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段；② 退火，快速降低温度至 50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段；③ 延伸，溶液反应温度升至 72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按 5’→3’ 方向复制出互 补DNA，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过 25-30 个循环后，DNA可 扩增 106 -109 倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理：
模板(Total) A 模板5 目的DNA 循环02中A+L+B 变性退火 5'o 5 循环】 A+LLL+B 延伸 4101 变性泪火 循环2 8222 循环3 1638 3 循环n2”n2”2nn 图21PCR基本原理示意图 Taq DNA聚合酶就是在PCR中常用的一种耐热DNA聚合酶，该酶分离自水生柄热菌， 分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3”一5'外切 酶活性，合成的DNA双链3'端常有一个突出的碱基A,便于与3”端有突出T的线性载体 (如T载体)直接进行重组连接，该特点在DNA重组中使用非常方便。 分离和纯化PCR产物及DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同 大小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得 目的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝周成凝胶。由 于双链DNA的解链温度高于65C,所以可以熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时 回收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR热循环仪、台式高心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5L)、200 uL.PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000L量程各一支)、胶带、 100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、.吸头、PE手套和乳胶手套
图 2-1 PCR 基本原理示意图 Taq DNA 聚合酶就是在 PCR 中常用的一种耐热 DNA 聚合酶，该酶分离自水生栖热菌， 分子量为 94,000，最适反应温度 75℃，对 95℃高温具良好稳定性，该酶不存在 3’→5’ 外切 酶活性，合成的 DNA 双链 3’ 端常有一个突出的碱基 A，便于与 3’ 端有突出 T 的线性载体 （如 T-载体）直接进行重组连接，该特点在 DNA 重组中使用非常方便。 分离和纯化 PCR 产物及 DNA 酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同 大小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得 目的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在 65℃时熔化成液体，在 30℃时凝固成凝胶。由 于双链 DNA 的解链温度高于 65℃，所以可以熔化凝胶而 DNA 并不变性，在凝胶成液态时 回收 DNA 片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5μL）、200μL PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）、胶带、 100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、点样板或 parafilm、吸头、PE 手套和乳胶手套
二、试剂 1.10×缓冲液 500 mmol/L KCI 100mmol/L Tris-C(pH8.3,室温) 15 mmol/L MgClz 2.DNA模板1ngL(以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板) 3.dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4.引物 引物15'GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA3 引物2 5'CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC3 引物溶液浓度：2μM 5.Taq酶 5 U/uL 6.低熔点琼脂糖 7.凝胶回收试剂盒 8.去离子水或TE(pH7.6 【实验步骤】 1.在200 pLPCR管内配制20uL反应体系： 反应物 体积 ddHzO 10.3 10xPCR缓冲液 2.0 dNTP 16(终浓度20一200uM) 引物1 2.0 引物2 2.0 模板DNA 2.0 Tag酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油
二、试剂 1. 10 × 缓冲液 500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3，室温） 15 mmol/L MgCl2 2. DNA 模板 1 ng/μL (以实验一提取的拟南芥基因组 DNA 为模板) 3. dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4．引物 引物 1 5′ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3′ 引物 2 5′ CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC 3′ 引物溶液浓度：2μM 5. Taq 酶 5 U/μL 6. 低熔点琼脂糖 7. 凝胶回收试剂盒 8. 去离子水或 TE（pH7.6） 【实验步骤】 1．在 200μL PCR 管内配制 20μL 反应体系： 反应物 体积 /μL ddH2O 10.3 10×PCR 缓冲液 2.0 dNTP 1.6（终浓度 20－200μM） 引物１ 2.0 引物 2 2.0 模板 DNA 2.0 Tag 酶 0.1 Total 20 视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油