0.90.5 ~71.2 0.4~61.5 0.2~32.00.1 ~2称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1XTAE缓冲液100ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50uIEB染色液，摇匀。14.灌胶(1）取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。(2）将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。(3）将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破(4）待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。(5）加入1XTAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。15.加样剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6×上样缓冲液1u1点于膜上数点，取5uI质粒DNA和2u1DNA分子标准(约1ug)分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的点样孔（记录点样顺序及点样量）。16．电泳接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿12cm处，切断电源，停止电泳。17.观察结果取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到2种或3种质粒形式。【注意事项】1.应先在实验前2天划线接种细菌，实验前1天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌操作。2.加入溶液I时可用力振荡，而加入溶液II5min后，如溶液不变粘稠（用移液嘴沾吸没有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。3．溶液I中的溶菌酶宜临用前加入。溶液I也应临用前用母液配制
6 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～3 2.0 0.1～2 称取 0.8g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入 1×TAE 缓冲液 100ml，置微波炉或水浴加热至完 全熔化，取出摇匀，稍冷却后加 50μl EB 染色液，摇匀。 14．灌胶 (1) 取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要 封严，不能留缝隙)。 (2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。 (3) 将冷却至 60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成 气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。 (4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽 中，注意凝胶点样端要靠近负极。 (5) 加入 1×TAE 缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。 15．加样 剪取适当大小的蜡膜(Parafilm 膜)，取 6×上样缓冲液 1μl 点于膜上数点，取 5μl 质粒 DNA 和 2μl DNA 分子标准(约 1μg)分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的 点样孔(记录点样顺序及点样量)。 16．电泳 接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA 片段是从负极向正极移动)。 DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过 5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿 1～ 2cm 处，切断电源，停止电泳。 17．观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴 防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA 存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到 2 种或 3 种质粒形式。 【注意事项】 1．应先在实验前 2 天划线接种细菌，实验前 1 天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌 操作。 2．加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ5min 后，如溶液不变粘稠(用移液嘴沾吸没 有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。 3．溶液Ⅰ中的溶菌酶宜临用前加入。溶液Ⅱ也应临用前用母液配制
4.琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和RNaseA处理的实验间隙，为便于电泳后直接可观察结果，EB可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。因此整个电泳过程均应戴手套操作5.EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的废液和器皿要分别处理好。附：一步法提取质粒DNA小规模快速制备质粒DNA是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒DNA既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒DNA制备方法[见：刘新光，刘文，梁念慈。一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法。基础医学与临床，1998，18(5)；396，可作为今后科研中大量筛选时使用。本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实用【操作步骤】1.收获1.5ml过夜培养菌液于1.5mlEP管中，在12000r/min离心10s。2.弃去培养液并尽量吸干(使用微量台式真空泵较方便)，加入50u1TE缓冲液(pH8.0)，用涡旋混合器振荡以悬浮细胞3.用1ml玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿(1:1)混合液1ml，每个EP管加入50ul，在涡旋混合器上振荡10s后，以12000r/min离心5min。4.小心取出40uI上清至另一个1.5mlEP管中，加入RNaseA至终浓度50ug/ml，室温放置5min。5.取5u1质粒溶液(与1uI6×上样缓冲液混合)进行0.6%~1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体DNA作对照，根据电泳结果即可判断有无外源DNA插入6．取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。实验23PCR扩增目的DNA【原理】聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)类似于DNA的天然复制过程，是一种体外扩增特异性DNA的技术。PCR是在模板DNA、两条寡核苷酸引物和4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下，耐热的 Taq DNA聚合酶催化的酶促反应。PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在
7 4．琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和 RNase A 处理的实验间隙，为便于电泳后直接 可观察结果，EB 可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。因此整个电泳过程均应戴手套操作。 5．EB 是 DNA 的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要 戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有 EB 的面朝里，有 EB 的废液和器皿 要分别处理好。 附：一步法提取质粒 DNA 小规模快速制备质粒 DNA 是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法 是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒 DNA 既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但 该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。 这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒 DNA 制备方法[见：刘新光，刘文，梁念慈. 一种快速可 靠的小量制备质粒 DNA 的方法. 基础医学与临床，1998，18(5)：396]，可作为今后科研中大量筛选时使 用。本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实 用。 【操作步骤】 1．收获 1.5ml 过夜培养菌液于 1.5ml EP 管中，在 12 000r/min 离心 10s。 2．弃去培养液并尽量吸干(使用微量台式真空泵较方便)，加入 50μl TE 缓冲液(pH8.0)，用涡旋混合 器振荡以悬浮细胞。 3．用 1ml 玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿(1:1)混合液 1ml，每个 EP 管加入 50μl，在涡旋混合器上振荡 10s 后，以 12 000r/min 离心 5min。 4．小心取出 40μl 上清至另一个 1.5ml EP 管中，加入 RNase A 至终浓度 50μg/ml，室温放置 5min。 5．取 5μl 质粒溶液(与 1μl 6×上样缓冲液混合)进行 0.6%～1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体 DNA 作对照，根据电泳结果即可判断有无外源 DNA 插入。 6．取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。 实验 23 PCR 扩增目的 DNA 【原理】 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)类似于 DNA 的天然复制过 程，是一种体外扩增特异性 DNA 的技术。PCR 是在模板 DNA、两条寡核苷酸引物和 4 种脱 氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下，耐热的 Taq DNA 聚合酶催化的酶促反应。PCR 反应的特 异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步：①变性：通过加热使 DNA 双螺旋 的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引 物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA，使引物和其互补的模板在