浙江大学博士学位论文 第一文献综述与立题依据 M0E分别为300和75（卫生部，2005a)。从上述结果来看，其对人类健康的潜在危 害应给予关注，建议采取合理措施降低食品中丙烯酰胺的含量，如尽可能避免连续 长时间或高温烹饪淀粉类食品，提倡合理营养，平衡膳食，改变油炸和高脂肪食品 为主的饮食习惯，减少因丙烯酰胺可能导致的健康危岩（卫生部，2005b)。 1.2食品中丙烯酰胺及其检测方法研究进展 1.2.1食品中丙烯酰胺检测方法的建立 早期的研究建立了糖类、田间作物和整菇中丙烯酰胺的气相色谱(GC)和高效 液相色谱(HPLC)定量检测方法(Tekel et al,.1989:Castle,.1993;Bologna et al.,1999)。 然而，这些方法缺乏足够的选择性和灵敏度，无法满足复杂食品基质中丙烯酰胺痕 量分析的需要。Rosn和Hellenas(2002)首次报道了采用同位素稀释的液相色谱 质谱联用(LCMS)技术检测热加工食品中丙烯酰胺的含量，确定了多重反应监测 (MRM)的定量模式下丙烯酰胺的母离子、定性离子和定量离子。此后，大量的研 究报道在此基础上优化了基于质谱技术的内烯酰胺检测方法(Wenzl et al,.2003)。气 相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法己被公认是检测 食品中丙烯酰胺含量的最常用和最准确的方法。 1.2.2食品中丙烯酰胺含量测定的试样预处理方法 在对样品进行GC-MS或LC-MSMS进样分析前，试样预处理的典型步骤如图 1-2所示。由于内烯酰胺是一种亲水性的小分子化合物，因此在常温下通常用水来提 取(Tareke etal,.200C,Rosen&Hellenis,2002;Becalskietal,2003):考虑到后期使 用旋转蒸发浓缩和回收溶剂的方便性，甲醇也可用作提取剂(Tateo&Bononi,.2003: 钟崇泳等，2004)。Youg等(2004)研究发现采川高浓度的氯化钠溶液提取，能明显 地抑制样品预处现过程中的乳化现象，提高内烯酰胺的回收率。另外，内酮和水的 混合溶液也可川于内烯酰胺的提取(Fauhl e1al,2002;Takatsukietal,.2003)。为了提 高提取效率，部分研究采取快速溶剂萃取(ASE)的方法(SFOPH,2002:Cavalliet al,. 5
浙江大学博七学位论文 第一章文献综述与立题依据 MOE分别为300和75(卫生部，2005a)。从上述结果来看，其对人类健康的潜在危 害应给予关注，建议采取合理措施降低食品中丙烯酰胺的含量，如尽可能避免连续 长时间或高温烹饪淀粉类食品，提倡合理营养，平衡膳食，改变油炸和高脂肪食品 为主的饮食习惯，减少因丙烯酰胺可能导致的健康危害(卫生部，2005b)。 1．2食品中丙烯酰胺及其检测方法研究进展 1．2．1食品中丙烯酰胺检测方法的建立 早期的研究建立了糖类、田间作物和蘑菇中丙烯酰胺的气相色谱(GC．)和高效 液相色谱(HPLC)定量检测方法(Tekel et a1．，1989；Castle，1993；Bologna el a1．，1999)。 然而，这些方法缺乏足够的选择性和灵敏度，无法满足复杂食品基质中丙烯酰胺痕 量分析的需要。Ros6n和Hellen；is 42002)首次报道了采用同位素稀释的液相色谱． 质谱联用(LC．MS)技术检测热加工食品中丙烯酰胺的含量，确定了多重反应监测 (MRM)的定量模式下丙烯酰胺的母离子、定性离子和定量离子。此后，大量的研 究报道在此基础上优化了基于质谱技术的丙烯酰胺检测方法(Wenzl et a1．，2003)。气 相色谱．质谱联用(GC．MS)和液相色谱．串联质谱(LC．MS／MS)法已被公认是检测 食品中丙烯酰胺含量的最常用和最准确的方法。 1．2．2食品中丙烯酰胺含量测定的试样预处理方法 在对样品进行GC．MS或LC．MS／MS进样分析前，试样预处理的典型步骤如图 1．2所示。由于丙烯酰胺是一种亲水性的小分子化合物，因此在常温下通常用水来提 取(Tareke et a1．，2000；Ros6n&Hellen2is，2002；Becalski el aL，2003)；考虑到后期使 用旋转蒸发浓缩和回收溶剂的方便性，甲醇也可川作提取剂(Tateo&Bononi，2003； 钏-崇泳等，2004)。Young等(2004)研究发现采川高浓度的氯化钠溶液提取，能明显 地抑制样晶预处理过程-l-的乳化现象，提高内烯酰胺的回收率。另外，内酮和水的 混合溶液也可川于丙烯酰胺的提取(Fauhl et aL，2002；Takatsuki et a1．，2003)。为了提 高提取效率，部分研究采取快速溶剂萃取(ASE)的方法(SFOPH，2002；Cavalli et a1．， 5
浙江大学博士学位论文 第一廉文献综述与立依搭 2003;usae1al,2006)。ASE法使溶剂萃取过程在升温加压状态下进行，以此提高萃 取效率。升温加速了萃取的动力学过程，而加压可以保证萃取溶剂始终处于低沸点 状态，从而实现安全而快速的萃取。 为了在样品预处理过程中控制损失情况和提高回收率，往往在均质化后添加内 标。目前最常用的内标是BCg-丙烯酰胺(Tareke et al.,2002;Wenzl et al.,2003: Lagalante&Felter,2004),另外还有lC-丙烯酰肢(Nemoto er al,.2002;Takatsukietal, 2003)、D-丙烯酰胺(0 mo et al,.2003;Perez&0 sterman-GoIkar,.2003X、N,W.二甲基 甲酰胺(Tareke et al,.2002)、甲基丙烯酰胺(Ahn et al.,2002)和丙酰胺(SQTS,2003)。 根据样品基质的复杂情况，在提取阶段还应考虑一些辅助措施，对于油脂含量高的 样品一般需要经过脱脂处理，脱脂溶剂可选择正己烷、石油醚或环己烷；对于蛋白 含量高的样品一般需要经过脱蛋白处理，可选用甲醇、乙腈或高浓度的盐溶液。例 如，通过添加1mL的0.68molL铁氰化钾溶液(Carrez I)和1mL的2molL硫酸 锌溶液(Carrez ll)充分涡流混合可在Imin内沉淀蛋白(Gertz&K1 lostermann,2002: Delatouretal,.2004)。 试样的纯化主要通过周相萃取(SPE)法进行。早期的实验一般都通过多步SPE 法来实现丙烯酰胺回收率最大化的日标。Becalski等(2003)采用依次经过阴离子交 换柱、阳离子交换柱和石墨化碳柱的方法进行纯化：Takatsuki等(2003)采用依次 经过C1:柱、阴离子交换柱和AccuCAT柱（以强阴阳离子吸附剂作为混合周定相填 料)的方法进行纯化。但是多步SPE法操作繁琐，不适用于大批量样品中的检测。 最近，SPE柱填料的优化使纯化过程趋于简单，如Oasis HLB SPE柱的填料是一种具 有亲水亲脂平衡特性的水浸润性反相吸附剂，已有不少研究报道了色谱分析前采用 此柱对试样进行纯化(Roach et al,.2003;Terada&Tamura,2003;刘慧等，2003)。同 时，Oasis MCX SPE柱以混合阳离子交换模式的反相吸附剂为填料，具有良好的纯化 效果。Youg等(2004)使川以上两种SPE柱对试样进行纯化，基本消除了样品基 质对质谱的干扰，使内烯酰胺的回收率达到98%以上，并具有良好的重现性。 如今，寻找快速、使捷、高回收率的萃取和纯化乃法对于食品中内烯酰胺的批量 检测和准确定量具有重要的意义。Mastovska和Lehotay(2006)优化了预处理方法， 将匀浆样品与适革的正己烷、水、乙腈、硫酸镁和氯化钠混，将乙脂层取出，经 6
浙江大学博士学位论文 第一章文献综述与立题依据 2003；Yus／I et a1．，2006)。ASE法使溶剂萃取过程在升温加压状态下进行，以此提高萃 取效率。升温加速了萃取的动力学过程，而加压可以保证萃取溶剂始终处于低沸点 状态，从而实现安全而快速的萃取。 为了在样品预处理过程中控制损失情况和提高回收率，往往在均质化后添加内 标。目前最常用的内标是13C3．丙烯酰胺(Tareke et aL，2002；Wenzl et a1．，2003； Lagalante&Felter,2004)，另外还有13CI-丙烯酰胺(Nemoto el a1．，2002；Takatsuki et a1．， 2003)、D3-丙烯酰胺(Ono et a1．，2003；P亡rez&Osterman．Golkar,2003)、Ⅳ'Ⅳ-二甲基 甲酰胺(Tareke etal．，2002)、甲基丙烯酰胺(Ahn etal．，2002)和丙酰胺(SQTS，2003)。 根据样品基质的复杂情况，在提取阶段还应考虑一些辅助措施，对于油脂含量高的 样品一般需要经过脱脂处理，脱脂溶剂可选择正己烷、石油醚或环己烷；对于蛋白 含量高的样品一般需要经过脱蛋白处理，可选用甲醇、乙腈或高浓度的盐溶液。例 如，通过添加1 mL的0．68 mol／L铁氰化钾溶液(Carrez I)和1 mL的2 mol／L硫酸 锌溶液(Carrez II)充分涡流混合可在1 min内沉淀蛋白(Gertz&Klostermann，2002； Delatour et a1．，2004)。 试样的纯化主要通过阎柏萃取(SPE)法进行。早期的实验一般都通过多步SPE 法来实现丙烯酰胺回收率最大化的f==1标。Becalski等(2003)采用依次经过阴离子交 换柱、阳离子交换柱和石墨化碳柱的方法进行纯化；Takatsuki等(2003)采用依次 经过C18柱、阴离子交换柱和AccuCAT柱(以强阴阳离子吸附剂作为混合固定相填 料)的方法进行纯化。但是多步SPE法操作繁琐，不适』}J于大批量样品中的检测。 最近，SPE柱填料的优化使纯化过程趋于简单，如Oasis HLB SPE柱的填料是一种具 有亲水．亲脂平衡特性的水浸润性反相吸附剂，已有不少研究报道了色谱分析前采用 此柱对试样进行纯化(Roach et a1．，2003；Terada&Tamura，2003；刘慧等，2003)。同 时，Oasis MCX SPE柱以混合阳离子交换模式的反相吸附剂为填料，具有良好的纯化 效果。Young等(2004)使川以上两种SPE柱对试样进行纯化，基本消除了样品基 质对质谱的干扰，使丙烯酰胺的回收率达到98％以上，并具有良好的重现性。 如今，寻找快速、便捷、高回收率的萃取和纯化方法对于食品l}1丙烯酰胺的批量 检测和准确定量具有重要的意义。Mastovska和Lehotay(2006)优化了预处理方法， 将匀浆样晶与适量的正己烷、水、乙腈、硫酸镁和氯化钠混匀，将乙脯层取出，经 6
浙江人学博土学位论文 第一章文献综述与立题依据 样品基质 SPE柱(C树脂，阴离子阳离子交换柱) 碎处理 加样0.5-2mL 用水洗脱 收集以后的3mL洗脱液 50g样品均质化 入浪化剂(100-300L) 2906雨 Br2溶液5mL 水60mL 冰浴 (0C) 静置1h SPE柱(C树邢，阴离子I阳离子交换柱) 1mL甲醇洗柱 2mL水预平衡 加样0.5-2mL 加入乙酸乙酯(4mL)提取 用水洗脱 乙酸乙酯相】 用Na2SO.4脱水 以15,00m 速离心10min 离心过滤50min,去除分子量大于3000的分子 LC-MS/MS GC-MS 图12食品中丙烯酰胺含量测定前试样预处理的典型步骤 Figure 1-2 Representative steps of sample pretreatment before the determination of acrylamide in samples 过伯仲胺吸附剂和尤水硫酸镁的混合填料SPE柱来实现纯化，达到了快速使捷的目 的。另外，其它.些影响因素，诸如样品匀浆的粘稠度、是否需要有机溶剂、萃取 温度、萃取时间、萃取循环次数、SPE洗脱溶剂的选择等，还需要进步的优化研究
浙江大学博十学位论文 第一章文献综述与立题依据 样品基质 ·～I ：一l$PE枉(Cls树脂，阴呙于／15H呙于父挟枉) m“，^“I№Ⅲ☆7lm☆7★*“、 ● l I 1 mL甲醇洗柱 ： 2mL水预平衡 ： I ● 破碎处理 加样0．5-2 mL ： 用水洗脱 ： 加入内标 ．一． ．．．。 l 。加7I(300—400mL 脱液丢弃 l≥II—I Y”7。.。.。 集以后的3埘川nL犹脱狠 50 g样品均质化 I l 上清液 加入溴化剂1100-300 pL) I KBrl6．2 g t ．，’～、． HBr 0．8 mL 20。c离心F 1冻融后20。c再L一 Br2溶液5mL 20 rain I 1次离心10 rain I 水60 mL 冰浴 (OoC) 静置1 h Y SPE柱(C伯树脂，阴离子，阳离子交换柱) 加入1 mollL Nal28203 1 mL甲醇洗柱 溶液(约10 pL) 2mL水预平衡 I 加样0．5．2mL 加入乙酸乙酯(4mL)提取 ，用水洗脱 前1 mL洗 收集以后的3 mL洗脱液 乙酸乙酯相l 脱液丢弃 ·——j●- (馏分2nd·7th。0．5 mL) 用Na2S04脱水 ● I ，7’ 、 1『 以15，000 rpm转速离心10 min 真空离心干燥 重新溶解于少 用0．22 pm滤膜过滤 (防止全干，很重要) 量的乙酸乙酯 离心过滤50 rain，去除分子量大于3000的分子 { i 真空离心干燥 加入25 IlL乙酸乙酯1 I LC．MS／MS ： GC ．MS ● 图1-2食晶中丙烯酰胺含量测定前试样预处理的典型步骤 Figure 1-2 Representative steps of sample pretreatment before the determination of acrylam ide in samples 过伯仲胺吸附剂和无水硫酸镁的混合填料SPE柱来实现纯化，达到了快速便捷的目 的。另外，其它.些影u向因素，诸如样占占匀浆的粘稠度、是否需要有机溶剂、萃取 温度、萃取时问、萃取循环次数、SPE洗脱溶剂的选择等，还需要进‘4步的优化研究。 7
浙江大学博士学位论文】 第一章文献综述与立愿依据 1.2.3基于GCMS方法的丙烯酰胺定量分析 GCMS技术是丙烯酰胺定量分析的常用方法之一，采用这种方法在纯化步骤之 前往往需要对样品进行衍生化(Heyns et al,.1966;Lindinger e1al,1993),溴化反应 是最常用的衍生化手段(Yoshidaer al,2002:Robarge et al,2003;Rothweiler,etal, 2004;Mizukami etal,.2006).溴衍生化可以降低丙烯酰胺的极性，使其更具有挥发性， 改善质谱响应特性。早期研究通过添加溴化钾、溴化氢和饱和溴水来进行衍生化反 应，将丙烯酰胺衍生化为2,3-二溴丙酰胺(2,3-DBPA),过量的溴用硫代硫酸钠淬灭， 衍生化反应也随即终止(Hashimoto,.1976)。当衍生化反应时间超过1h时该衍生物 的得率几乎不变(US EPA,1996)。2,3-DBPA与丙烯酰胺相比极性明显降低，可溶于 一些弱极性溶剂，利于GC-MS的进样分析。然而，Andrawes等(1987)研究认为 2,3-DBPA在进样口高温条件下会转化为2溴丙烯酰胺(2-BPA),从而降低了定量的 准确性和重现性。因此，在衍生化过程中通过添加10%的三乙胺溶液主动实现这种 转化，可以提高定量的准确性。除了溴衍生化以外，有研究报道采用顶空固相微萃 取方法通过硅烷化作用将丙烯酰胺衍生化为挥发性的N,O双（三甲基硅基）丙烯酰胺 W,0O-bis-((trimethylsilyDacrylamide](Lagalante&Felter,2004),另有研究报道通过丙 烯酰胺与L-缬氨酸以及五氟苯基异硫氰酸酯(pentafluorophenylisothiocyanate)的反 应生成五氟苯基统代乙内酰脲(pentafuorophenylthiohydantoin)衍生物(Perez& Osterman-GoIkar,.2003).无论采用何种衍生化方法，其日的均在于降低丙烯酰胺的极 性，改善在GC分离中的保留时间和峰形。 在进行定量分析时，常采用3℃-丙烯酰胺作为内标，可使加标回收率的相对标 准偏差(RSD)落在7.5%以内(Tareke e1al,2002).在此条件下，2-BPA的特征性 离子为[C3HANO=70、ICH,BrNO旷=149和[CH41BrNO旷=151，将m149作为 定量离子：2-澳(C)内烯酰胺的特征性离子为CHBr=110和rCH,"BNO= 154,将mkI54作为定量离子。通过溴衍生化可使内烯酰胺的GC-MS定量分析的最 低检测限(L0D)小于10μgkg。 近期的些研究尝试采用不通过衍生化直接进样的方式对丙烯酰肢进行GC-MS 定量分析[Biedermann et al,.2002a;Tateo&Bononi,2003;Wiertz-.Eggert-.J6 rissen 8
浙江大学博士学位论文 第一章文献综述与立题依据 1．2．3基于GC-MS方法的丙烯酰胺定量分析 GC．MS技术是丙烯酰胺定量分析的常用方法之一，采用这种方法在纯化步骤之 前往往需要对样品进行衍生化(Heyns el aI．，1966；Lindinger et a1．，1993)，溴化反应 是最常用的衍生化手段(Yoshida et a1．，2002；Robarge el a／．，2003；Rothweiler,el a1．， 2004；Mizukami et al,，2006)。溴衍生化可以降低丙烯酰胺的极性，使其更具有挥发性， 改善质谱响应特性。早期研究通过添加溴化钾、溴化氢和饱和溴水来进行衍生化反 应，将丙烯酰胺衍生化为2，3．二溴丙酰胺(2，3．DBPA)，过量的溴用硫代硫酸钠淬灭， 衍生化反应也随即终止(Hashimoto，1 976)。当衍生化反应时间超过1 h时该衍生物 的得率几乎不变(US EPA，1996)。2,3．DBPA与丙烯酰胺相比极性明显降低，可溶于 一些弱极性溶剂，利于GC．MS的进样分析。然而，Andrawes等(1987)研究认为 2，3一DBPA在进样口高温条件下会转化为2．溴丙烯酰胺(2．BPA)，从而降低了定量的 准确性和重现性。因此，在衍生化过程中通过添加10％的三乙胺溶液主动实现这种 转化，可以提高定量的准确性。除了溴衍生化以外，有研究报道采用顶空固相微萃 取方法通过硅烷化作用将丙烯酰胺衍生化为挥发性的Ⅳ’D双(三甲基硅基)丙烯酰胺 ．【Ⅳ’D—bis一(trimethylsilyi)acrylamide】(Lagalante&Feiter，2004)；另有研究报道通过丙 烯酰胺与L一缬氨酸以及五氟苯基异硫氰酸酯(pentafluorophenylisothiocyanate)的反 ．应生成五氟苯基硫代乙内酰脲(pentafluorophenylthiohydantoin)衍生物(P6rez& Osterman．Goikar,2003)。无论采用何种衍生化方法，其目的均在于降低丙烯酰胺的极 性，改善在GC分离中的保留时间和峰形。 在进行定量分析时，常采用13C，．丙烯酰胺作为内标，可使加标回收率的相对标 准偏差(RSD)落在7．5％以内(Tareke et a1．，2002)。在此条件下，2-BPA的特征性 离子为【C3H4NO]+=70、【C3H479BrNO]+=149和【C3H481BrNO]+=151，将m／z 149作为 ．定量离子；2．溴(13C3)内烯酰胺的特征性离子为【"C2H38 1Br]+=1 10和[13C3H48]BFNO]+= 154，将m／z 154作为定量离子。通过溴衍生化可使丙烯酰胺的GC．MS定量分析的最 低检测限(LOD)小于10}tg／kg。 近期的一’些研究尝试采J{j不通过衍生化直接进样的方式对丙烯酰胺进行GC．MS 定量分析【Biedermann el a1．，2002a；Tateo&Bononi，2003；Wiertz—Eggert．J6rissen 8
浙江大学博士学位论文 第一章文献综述与立题依据 (WE)GmbH,2003]。使用非衍生化方法时，色谱柱通常选用极性填料，如聚乙烯乙 二醇：电离模式下主要碎片离子为mk71和55，这些碎片离子可用于定量分析，但 是其它一些小分子物质如麦芽醇和庚酸也可产生相同的碎片离子，可能使定量分析 受到干扰(Biedermann et al,.2002)。基于GC方法的丙烯酰胺定量分析研究进展及 相关文献报道汇总于表1-2，主要列出了内标、衍生化方法、色谱柱、进样条件、方 法学论证参数和质谱参数等。 1.2.4基于LCMS/MS方法的丙烯酰胺定量分析 与GC-MS相比，作为另一种常用的丙烯酰胺定量分析方法，LC-MSMS的试样 无需衍生化处理。很多研究都用lypercarb柱(5um填料粒径)作为丙烯酰胺的色 谱分离柱(Tareke et al,.2000:Rosen&Hellenas,2002;Becalski et al,.2003).但是， 用常规的反相色谱分离极性化合物时，遇到的问题是这些极性化合物没有色谱保留 或与其它杂质一同洗脱。后来，研究发现采用Atlantis dCs柱可以调节反相色谱中极 性和非极性化合物保留时间的平衡，改善蜂形，提高重现性。Oo等(2003)采用该 柱分离丙烯酰胺时获得了足够的保留时间和良好的分离效果，并且最大限度地减少 了在质谱分析中的背景干扰。 9
浙江大学博士学位论文 第一章文献综述与立题依据 (WEJ)GmbH，2003]。使用非衍生化方法时，色谱柱通常选用极性填料，如聚乙烯乙 二醇；电离模式下主要碎片离子为m／z 71和55，这些碎片离子可用于定量分析，但 是其它～些小分子物质如麦芽醇和庚酸也可产生相同的碎片离子，可能使定量分析 受到干扰(Biedermann el a1．，2002)。基于GC方法的丙烯酰胺定量分析研究进展及 相关文献报道汇总于表1．2，主要列出了内标、衍生化方法、色谱柱、进样条件、方 法学论证参数和质谱参数等。 1．2．4基于LC-MS／MS方法的丙烯酰胺定量分析 与GC．MS相比，作为另一种常用的丙烯酰胺定量分析方法，LC．MS／MS的试样 无需衍生化处理。很多研究都用Hypercarb柱(5 lain填料粒径)作为丙烯酰胺的色 谱分离柱(Tareke et a1．，2000；Ros6n&Helleniis，2002；Becalski et a1．，2003)。但是， 用常规的反相色谱分离极性化合物时，遇到的问题是这些极性化合物没有色谱保留 或与其它杂质一同洗脱。后来，研究发现采用Atlantis dCl8柱可以调节反相色谱中极 性和非极性化合物保留时问的平衡，改善峰形，提高重现性。Ono等(2003)采用该 柱分离丙烯酰胺时获得了足够的保留时间和良好的分离效果，并且最大限度地减少 了在质谱分析中的背景干扰。 9