需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 转化( Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞使之获得新的遗传性状的一种手段它是 生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变体(RM),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊 方法(如电击法CaCl,RbCl(KCI)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成 为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制, 表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培 养,即可筛选出转化子( Transforman即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制 备方法有CaC2和RbC(KC1)法, RbC(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCn2法简便 行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15%的无菌甘油于70℃保存(半年),因此CaC2法为使用更广泛。 为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从一70℃或-20℃甘 油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好 可通过监测培养液的OD600来控制。DH5a菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个m左右 (不同的菌株情况有所不同,这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率 2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA( CCCDNA)转化效率与外 源DNA的浓度在一定范围内成正比但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降 低。1ng的 CCcDNA即可使50u的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感 受态细胞体积的5%。 3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCn2等均需是最高纯度的(GR或AR)并用超纯水配制最好 分装保存于干燥的冷暗处。 4.防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tp 头等最好是新的并经高压灭菌处理所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA 所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以 E coli dhsa菌株为受体细胞并用CaC处理,使其处于感受态然后与pBS质粒共保 温实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。如 受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转 化子)肯定已导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。 本实验以 E coli dh5a菌株为受体细胞并用caC2处理,使其处于感受态然后与pBS质粒共保 温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。如 受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转 化子)肯定己导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。 第二节材料、设备及试剂 材料 E coli DH5a菌株:R,MAmp:pBS质粒DNA:购买或实验室自制, eppendorf管。 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光
11 需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是 微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊 方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成 为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制, 表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培 养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制 备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但 CaCl2 法简便易 行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 CaCl2 法为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘 油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好， 可通过监测培养液的 OD600 来控制。DH5α 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5×107 个/ml 左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化效率与外 源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降 低。1ng 的 cccDNA 即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感 受态细胞体积的 5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或 AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保 温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如 受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转 化子）肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保 温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如 受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转 化子）肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 第二节 材料、设备及试剂 一. 材料 E. coli DH5α 菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 质粒 DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光
光度计微量移液枪 三.试剂 1LB固体和液体培养基:配方见第一章 2Amp母液:配方见第一章 3含Amp的LB固体培养基将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储 存液,使终浓度为5 Oug/ml,摇匀后铺板 4麦康凯培养基( Maconkey Agar)取52g麦康凯琼脂加蒸馏水100mn,微火煮沸至完全溶解高压 灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为5ugml,然后摇匀后涂板 5005 mol/ Cac2溶液:称取0.28gCaC2(无水,分析纯)溶于50ml重蒸水中定容至100m,高压 6含15%甘油的005 mol/ cac2:称取0.28gCaC2(无水分析纯,溶于50m重蒸水中,加入15m 甘油定容至100m高压灭菌。 第三节操作步骤 、受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli dh5a单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37°℃下振荡 培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100m1LB液体培养 基中,37℃振荡培养2-3小时至0D600=0.5左右 二、感受态细胞的制备(caC12法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4°C下3000g离心10分钟 2、弃去上清,用预冷的0.05mo1/L的CaC12溶液10m1轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟 后,4°C下3000g离心10分钟 3、弃去上清,加入4m1预冷含15%甘油的0.05mo1/L的CaC12溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几 分钟,即成感受态细胞悬液。 4、感受态细胞分装成200u1的小份,贮存于-70°C可保存半年 三、转化 1、从-70°C冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10u1),轻轻摇匀,冰上放置30分钟 3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟 4、向管中加入 ImI lB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生 长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr) 5、将上述菌液摇匀后取100μ1涂布于含Am的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全 被培养基吸收后倒置培养皿,37℃C培养16-24小时, 同时做两个对照 对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗 生素的LB平板上应没有菌落出现 对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5ψ1菌液涂布于不含抗生素的 LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落
12 光度计,微量移液枪。 三. 试剂 1.LB 固体和液体培养基：配方见第一章。 2.Amp 母液：配方见第一章。 3.含 Amp 的 LB 固体培养基:将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60℃左右,加入 Amp 储 存液,使终浓度为 50ug/ml,摇匀后铺板。 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取 52g 麦康凯琼脂,加蒸馏水 1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压 灭菌，待冷至 60℃左右加入 Amp 储存液使终浓度为 50ug/ml,然后摇匀后涂板。 5.0.05mol/L CaCl2 溶液:称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于 50ml 重蒸水中,定容至 100ml,高压 灭菌。 6.含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl2: 称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于 50ml重蒸水中,加入 15ml 甘油,定容至 100ml,高压灭菌。 第三节 操作步骤 一、 受体菌的培养 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5α 单菌落,接种于 3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡 培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB 液体培养 基中,37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置 10 分钟,然后于 4℃下 3000g 离心 10 分钟。 2、 弃去上清,用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟 后,4℃下 3000g 离心 10 分钟。 3、弃去上清,加入 4ml 预冷含 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几 分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞分装成 200μl 的小份,贮存于-70℃可保存半年。 三、 转化 1、从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 2、 加入 pBS 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10μl),轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟 后。 3、42℃水浴中热击 90 秒或 37℃水浴 5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。 4、向管中加入 1ml LB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37℃振荡培养 1 小时,使细菌恢复正常生 长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全 被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养 16-24 小时。 同时做两个对照: 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗 生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落
四、计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数 和转化频率,公式如下 转化子总数=菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DN加入量(mg) 感受态细胞总数一对照组2菌落数x稀释倍数x菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数 [注意]本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效 率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的 转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 思考题 1.制备感受态细胞的原理是什么? 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落,你将如何解释这种现象? 第四章RNA的提取和cDNA合成 第一节概述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成CDNA的第一链和第二链将 双链cDNA和载体连接,然后转化扩增,即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基 因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转 录后加工等一系列问题。总之CDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70 年代中叶首例cDNA克隆问世以来已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体 系统,目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第 链,聚合酶合成cDNA第二链加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 RNA制备 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点容易受RNA 酶的攻击反应而降解加上RNA酶极为稳定且广泛存在因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污 染,并设法抑制其活性这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试 剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。 所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器 等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂, 它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEC与氨水溶液混合会产生致癌物, 因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DFPC处理,加入DEPC至0.1%浓度然后剧烈振荡10分 钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活 性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC 理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌可用DEPC处理水配制并尽可能用未曾
13 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数 和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每 mg 质粒 DNA）＝转化子总数／质粒 DNA 加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 [注意] 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们的转化效 率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的 转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 思考题 1. 制备感受态细胞的原理是什么？ 2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ 第四章 RNA 的提取和 cDNA 合成 第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA,通过酶促反应逆转录合成 cDNA 的第一链和第二链,将 双链 cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得 cDNA 文库,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基 因的结构、表达和调控的分析;比较 cDNA 和相应基因组 DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转 录后加工等一系列问题。总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来,已发展了许多种提高 cDNA 合成效率的方法,并大大改进了载体 系统，目前 cDNA 合成试剂已商品化。cDNA 合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成 cDNA 第 一链,聚合酶合成 cDNA 第二链,加入合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 一、RNA 制备 模板 mRNA 的质量直接影响到 cDNA 合成的效率。由于 mRNA 分子的结构特点,容易受 RNA 酶的攻击反应而降解,加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污 染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在 RNA 酶,人的皮肤、手指、试 剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中 200℃烘烤 2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器 等皆可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂, 它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物, 因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理,加入 DEPC 至 0.1%浓度,然后剧烈振荡 10 分 钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC,否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活 性。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾
开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了 避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上所有器皿一律需经硅烷化处理。 细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂 盒可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA3末端含有多聚(AH的特 点当RNA流经olgo(dn)纤维素柱时在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在 oligo(dT纤维素 上然后逐渐降低盐浓度洗脱在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次 oligo(dT纤维素柱 「得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中70℃可保存一年以上 二、cDNA第一链的合成 所有合成CDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前 商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克 隆化的 Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。 AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依 赖于DNA的DNA合成以及对 DNA RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)MIV 反转录酶只有单个多肽亚基兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解 RNA DNA 杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MIV反转录酶能合成较长的 DNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成CDNA时的最适pH值, 最适盐浓度和最适温室各不相同所以合成第一链时相应调整条件是非常重要 AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物 是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的olgo(dD) 三、cDNA第二链的合成 cDNA第二链的合成方法有以下几种 (1)自身引导法合成的单链cDNA3端能够形成一短的发夹结构这就为第二链的合成提供了 现成的引物,当第一链合成反应产物的 DNA RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow 片段或反转录酶合成cDNA第二链最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但 自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5 端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 (2)置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的 CDNA mRNA杂交链不用碱变性, 而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA 引物使之成为合成第二链的引物在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成第二链。该反应有3个主 要优点:(1)非常有效;(2)直接利用第一链反应产物无须进一步处理和纯化,(3)不必使用S1核酸 酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。 四、cDNA的分子克隆 已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上 接头 Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的 末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴退火后形成重组质粒并转化到宿主菌中进行扩增。合 成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。 第二节动植物组织mRNA提取 材料 水稻叶片或小鼠肝组织
14 开封的试剂。除 DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了 避免 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。 细胞内总 RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总 RNA 提取试剂 盒,可快速有效地提取到高质量的总 RNA。分离的总 RNA 可利用 mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特 点,当 RNA 流经 oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异的吸附在 oligo(dT)纤维素 上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA 被洗下。经过两次 oligo(dT)纤维素柱, 可得到较纯的 mRNA。纯化的 mRNA 在 70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 二、cDNA 第一链的合成 所有合成 cDNA 第一链的方法都要用依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前 商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克 隆化的 Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。 AMV 反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于 RNA 的 DNA 合成,依 赖于 DNA 的 DNA 合成以及对DNA:RNA 杂交体的 RNA 部分进行内切降解(RNA 酶 H 活性)。MLV 反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于 RNA 和依赖于 DNA 的 DNA 合成活性,但降解 RNA:DNA 杂交体中的 RNA 的能力较弱,且对热的稳定性较 AMV 反转录酶差。MLV 反转录酶能合成较长的 cDNA(如大于 2-3kb)。AMV 反转录酶和MLV 反转录酶利用 RNA 模板合成 cDNA 时的最适 pH 值, 最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 AMV 反转录酶和 MLV 反转录酶都必须有引物来起始 DNA 的合成。cDNA 合成最常用的引物 是与真核细胞 mRNA 分子 3'端 poly(A)结合的 12-18 核苷酸长的 oligo(dT)。 三、cDNA 第二链的合成 cDNA 第二链的合成方法有以下几种: (1) 自身引导法 合成的单链 cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了 现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA 杂交链变性后利用大肠杆菌DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段或反转录酶合成 cDNA 第二链,最后用对单链特异性的 S1 核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但 自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5' 端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 (2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA 杂交链不用碱变性, 而是在dNTP 存在下,利用RNA 酶 H 在杂交链的 mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA 引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有 3 个主 要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用 S1 核酸 酶来切割双链 cDNA 中的单链发夹环。目前合成 cDNA 常采用该方法。 四、cDNA 的分子克隆 已经制备好的双链 cDNA 和一般 DNA 一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上 接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA 的 末端接上一段寡聚 dG 和 dC 或 dT 和 dA 尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合 成的 cDNA 也可以经 PCR 扩增后再克隆入适当载体。 第二节 动植物组织 mRNA 提取 一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织
设备 研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。 三、试剂 1、无RNA酶灭菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入001%的 DEPC(体积体积),处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇:用DFPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的 玻璃瓶中,存放于低温冰箱。 3、1×层析柱加样缓冲液;20 mmolL Tris CI(pH7.6),0.5 mol/L NaCl, I mmoL EDTA(pH!.0) 0.1%SDS。 4、洗脱缓冲液:10 mmol/L Tris CI(pH76), Immol/L EDta(pH8.0),0.05%SDS 四、操作步骤 (一)动植物总RNA提取- Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用 Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于 Norther斑点分析,斑点杂交, Ply(A)+分离,体外翻译, RNase封阻分析和分子克隆 1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入 Iml trizol液研磨,注意样品总体积 不能超过所用 Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟,然后以每 ImITrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管, 用手剧烈摇荡离心管15 3、取上层水相于一新的离心管,按每 trIzol液加0.5m异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置 10分钟,12000g离心10分钟。 4、弃去上清液,按每 ml trizol液加入至少lml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g 离心5分钟。 5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离, 或贮存于70%乙醇并保存于70℃ 注意]1l、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作 2、加氯仿前的匀浆液可在70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周, -20℃保存一年 二)mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径 oligo(dn纤维素时,在高盐缓冲液作用下, mRNA被特异的吸附在olgo(d)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两 次olgo(d纤维素柱,可得到较纯的mRNA 1、用0. I mol/ naoh悬浮0.5-1.0 oligo(dm纤维素。 2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴 斯德吸管中,柱床体积为0.5-10ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。 4、将(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓
15 二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 1、无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入 0.01%的 DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用 DEPC 处理水配制 75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的 玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)， 0.1% SDS。 4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。 四、操作步骤 （一）动植物总 RNA 提取-Trizol 法 Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。 1、将组织在液 N 中磨成粉末后，再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积 不能超过所用 Trizol 体积的 10%。 2、研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管， 用手剧烈摇荡离心管 15 秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10 分钟，12000g 离心 10 分钟。 4、弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 7500g 离心 5 分钟。 5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度。然后将 RNA 溶于水中，必要时可 55℃-60℃水溶 10 分钟。RNA 可进行 mRNA 分离， 或贮存于 70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA 沉淀在 70%乙醇中可在 4℃保存一周， -20℃保存一年。 （二）mRNA 提取 由于 mRNA 末端含有多 poly(A)+，当总 RNA 流径 oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下， mRNA 被特异的吸附在 oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两 次 oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。 1、用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴 斯德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0ml，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的 pH 值小于 8.0。 4、将（一）中提取的 RNA 液于 65℃温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积 2x 柱层析缓