《基因工程操作技术》第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定

第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫 载体( (Vector))。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体 质粒( Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制 和转录能力能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依 赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常 存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒 R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒 粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型( Stringent contro和松驰控制型( Relaxed contro)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制当染色体不复制时它也不能复制,通常每个细胞内 只含有1个或几个质粒分子如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制在每个细胞中 有许多拷贝,一般在20个以上如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时细胞内蛋白质合 成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷 贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在当两种质粒同时导入同一细胞 时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些 细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后占少数的质粒将会丢失因而在细胞后代中只有两 种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性( compat ibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳 定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性产生某些抗生素降解复杂有机物产 大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比质粒载 体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制 性内切酶识别位点的多克隆位点序列并去掉了大部分非必需序列使分子量尽可能减少以便于基因 工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组 克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因 的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型: 2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点:(3)能插入较大的外源DNA片段:(4)具有容易操 作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系 列和 pBluescript(简称pBS) 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增:收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 TritonⅩ-100可使 细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上, 同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性 片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性而共价闭合环状DNA( Covalently closed circular DNa,简称cDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体

1 第一章 质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫 载体(Vector)。细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从 1-200kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制 和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依 赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常 存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称 F 因子或性质粒)、 R 质粒(抗药性因子)和 Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内 只含有 1 个或几个质粒分子,如 F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中 有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合 成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷 贝数可由原来 20 多个扩增至 1000-3000 个,此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞 时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些 细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两 种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳 定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产 生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载 体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制 性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因 工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组 克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因 的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型； （2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源 DNA 片段；（4）具有容易操 作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在 1kb 至 10kb 之间，如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系 列和 pBluescript（简称 pBS）等。 从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 Triton X-100 可使 细胞膜裂解。经溶菌酶和 SDS 或 Triton X-100 处理后,细菌染色体 DNA 会缠绕附着在细胞碎片上, 同时由于细菌染色体 DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性 片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体 DNA 变性,而共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体

NA片段难以复性而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起而质粒DNA双链又恢复原状,重新 形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中 在细菌细胞内共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还 会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂分子就能旋转 而消除链的张力形成松驰型的环状分子称开环 DNA(Open circular DNA,简称 OCDNA):如果质粒 DNA的两条链在同一处断裂则形成线状DNA( Linear dna)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快 第二节材料、设备及试剂 材料 含pBS的 E coli h5a或JM系列菌株,1.5m塑料离心管(又称 eppendorf管),离心管架 设备 微量取液器(20μ山,20oμl0o0u),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅) 涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。 三、试剂 1、LB液体培养基( Luria- Bertani):称取蛋白胨( Tryptone)10g,酵母提取物( Yeast extract5g, NaCl10g,溶于800m去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升高压下蒸气 菌20分钟。 2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉高压灭菌 3、氨苄青霉素( Ampicillin,Amp)母液:配成50mgm水溶液,-20℃保存备用 4、溶菌酶溶液:用10mmol. Tris CI(pH8.0)溶液配制成l0mg/m,并分装成小份(如1ml)保 存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃 5、3 mol naAc(pH52):50ml水中溶解40.81 o naAc3H2O,用冰醋酸调pH至52,加水定容 至10om,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱 6、溶液Ⅰ:50mmoL葡萄糖,25 mmol/ Tris Cl(pH80),10 mmOLL EDTA(pH8.0)。溶液 Ⅰ可成批配制,每瓶100m高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱 7、溶液Ⅱ:0.2 molL NaoH(临用前用10 molL NaOH母液稀释),1%SDS 8、溶液Ⅲ:5 mol/L Kac60m,冰醋酸1!5ml,HO28.5ml,定容至10oml,并高压灭菌 溶液终浓度为K+3mol,Ac5mo/L 9RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10 mmol/ Tris CI(pH7.5,15 mmol/L NaCl中配成10 mg/ml 的溶液于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用15 ml eppendorf管分装成小份保存 于-20℃ 10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂并用等体积 的0.5 molL Tris Cl(pH80)和o.1 mol/L Tris CI(pH80)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到76 以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相 11、氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相 的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫 按体积体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿 即得酚氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。 12、TE缓冲液:10 mmo/ Tris Cl(pH8.0),1 mmoLL edta(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃

2 DNA 片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新 形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋 DNA 外，还 会产生其它形式的质粒 DNA。如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转 而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环 DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒 DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒 DNA 电泳时,同一质粒 DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 第二节 材料、设备及试剂 一、材料 含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株，1.5ml 塑料离心管(又称 eppendorf 管),离心管架。 二、设备 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。 三、试剂 1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g， NaCl 10 g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5, 加去离子水至总体积 1 升,高压下蒸气 灭菌 20 分钟。 2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成 10mg/ml,并分装成小份(如 1.5ml)保 存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解 40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调 pH 至 5.2, 加水定容 至 100ml, 分装后高压灭菌,储存于 4℃冰箱。 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液 Ⅰ可成批配制,每瓶 100ml,高压灭菌 15 分钟,储存于 4℃冰箱。 7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。 溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 9、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存 于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联,应在 160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1％的 8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积 的 0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和 0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上,因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相。 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相 的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿 即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、 TE 缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于 4℃

冰箱中 13. STET: 0.1 mol/L NaCl, 10mmol/L Tris CI(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5%Triton 14, STE: 0. Imol/L NaCl, 10mmol Tris- CI(pH8.0), Immol/L EDTA(pH8.0) 15、电泳所用试剂:(1)TBE缓冲液(5×):称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDT (pH80)20m,定溶至100mnl。(2)上样缓冲液(6×):0.25%溴酚蓝,40%(w)蔗糖水溶液 第三节操作步骤 、细菌的培养和收集 将含有质粒pBS的DHsa菌种接种在LB固体培养基(含5opg/ ml Amp)中,37℃培养12-24小时 用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μ g/ml Amp中,37℃振荡培养约12小时至对 生长后期 二、质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法 共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样所得DNA有一定纯度可满足限制酶切割、电泳分析 的需要。 (一)、煮沸法 1、将15ml培养液倒入 eppendorf管中4℃下12000g离心30秒 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽 3、将菌体沉淀悬浮于120 mI STEt溶液中,涡旋混匀。 4、加λ1om新配制的溶菌酶溶液( 10mg/m),涡旋振荡3秒钟 5、将 eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟 7、用无菌牙签从 eppendorf管中去除细菌碎片 8、取20m进行电泳检查 注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA 2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶 3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验如限制性内切酶消化亚克隆 及连接反应等 (二)、碱法 1、取1.5m培养液倒入1 5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒 2、弃上清将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽 3、菌体沉淀重悬浮于100μ溶液I中(需剧烈振荡,室温下放置5-10分钟 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μ,盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf管数次以混匀内容物(千万 不要振荡)冰浴5分钟。 5加入150预冷的溶液盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒使沉淀混匀冰浴中510 ,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净 eppendorf管中,加入等体积的酚氯仿(1:1),振荡混匀4℃下12000离心5分

3 冰箱中。 13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。 14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15、 电泳所用试剂：（1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。 第三节 操作步骤 一、 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在 LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。 用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基(含 50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约 12 小时至对 数生长后期。 二、 质粒 DNA 少量快速提取 质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用。这些方法 共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得 DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析 的需要。 （一）、煮沸法 1、将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中,4℃下 12000ｇ离心 30 秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中, 涡旋混匀。 4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡 3 秒钟。 5、将 eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。 6、用微量离心机 4℃下 12000g 离心 10 分钟。 7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。 8、取 20ml 进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶 菌。 3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA,但 RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆 及连接反应等。 （二）、 碱法 1、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,4℃下 12000g 离心 30 秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置 5-10 分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万 不要振荡),冰浴 5 分钟。 5、加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10 秒,使沉淀混匀,冰浴中 5-10 分钟,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。 6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下 12000g 离心 5 分 钟

7、将水相移入干净 eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇振荡混匀后置于-20℃冰箱中20 分钟,然后4℃下12000g离心10分钟 8、弃上清将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70%乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥 10、将沉淀溶于20μTE缓冲液(pH8.0,含20 g/ml rnaseA)中,储于-20℃冰箱中 注意]1.提取过程应尽量保持低温 2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要采用酚氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好要将 蛋白尽量除干净需多次抽提 3.沉淀DNA通常使用冰乙醇在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也 可用异丙醉(一般使用等体积且沉淀完全,速度快但常把盐沉淀下来所以多数还是用乙醇 三)、 Wizard少量DNA纯化系统 Promega公司的Ward少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟 提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括10m细胞 悬浮液,10ml细胞裂解液:10ml中和液,50 ml wizard少量DNA纯化树脂,5oml柱洗液(使用前 加95%乙醇至120ml)和50支 Wizard微型柱 1-3ml过夜培养细胞液4℃下12000离心1-2分钟。 2、去除上清液,菌体细胞悬浮于200μ细胞悬浮液中充分混合并移入 eppendorf管中 3、加200μd细胞裂解液,颠倒离心管数次,直到溶液变清亮 4、加200u中和液颠倒离心管数次。 5、4℃下12000g离心5分钟,取上清液于新的 eppendorf管中 6、加1 mI wizard少量DNA纯化树脂颠倒离心管数次以充分混匀 7、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒与 Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注 射筒中,并用注塞轻推使混合物进入微型柱 8、将注射器与微型柱分开取出注塞,再将注射筒与微型柱相连加入2m柱洗液并用注塞轻推 使柱洗液进入微型柱 9、取出微型柱置于 eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10、将微型柱放在一个新 eppendorf管中,加50udTF(或水)于微型柱中,静止1分钟后,4℃下 1l、丢弃微型柱,将 eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。 注意]树脂使用前应充分混匀如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提 取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化常用柱层析法和氯化绝梯度离心法 (一)、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250m,4℃下5000g离心15分钟,弃上 清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50m用冰预冷的STE中(此步可省略)

4 7、将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中 20 分钟，然后 4℃下 12000g 离心 10 分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于 20μl TE 缓冲液(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。 [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将 蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。沉淀 DNA 也 可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 （三）、Wizard 少量 DNA 纯化系统 Promega公司的Wizard 少量 DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15 分钟。 提取的质粒可直接用于 DNA 测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于 50 次 1-3ml 质粒培养液的分离和纯化，试剂包括 10ml 细胞 悬浮液，10ml 细胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂，50ml 柱洗液（使用前 加 95%乙醇至 120ml )和 50 支 Wizard 微型柱。 1、 1-3ml 过夜培养细胞液 4℃下 12000g 离心 1-2 分钟。 2、去除上清液，菌体细胞悬浮于 200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入 eppendorf 管中。 3、 加 200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。 4、加 200μl 中和液,颠倒离心管数次。 5、4℃下 12000g 离心 5 分钟，取上清液于新的 eppendorf 管中。 6、加 1ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与 Wizard 微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注 射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。 8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推， 使柱洗液进入微型柱。 9、取出微型柱置于 eppendorf 管中,离心 2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10、将微型柱放在一个新 eppendorf 管中，加 50μl TE(或水)于微型柱中，静止 1 分钟后，4℃下 12000g 离心 20 秒。 11、丢弃微型柱，将 eppendorf 管中的质粒 DNA 贮于 4℃或-20℃冰箱。 [注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用 25-37℃水浴处理 10 分钟。 三、质粒 DNA 的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒 DNA,为此需要大量提 取质粒 DNA。大量提取的质粒 DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含 pBS 质粒的细菌培养液 250ml，4℃下 5000g 离心 15 分钟,弃上 清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于 50ml 用冰预冷的 STE 中（此步可省略）

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于5m溶液I中充分悬浮菌体细胞。 5、加入12m新配制的溶液Ⅱ,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物冰浴10分 6、加9ml用冰预冷的溶液Ⅲ,摇动离心管数次以混匀内容物冰上放置15分钟,此时 色絮状沉淀。 7、4℃下5000g离心15分钟。 8、取上清液加入50 mI RNA酶A(l0mgm),37℃水浴20分钟。 9、加入等体积的饱和酚氯仿振荡混匀4℃下1200g离心10分钟 10、取上层水相,加入等体积氯仿振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。 1l、取上层水相,加入1/5体积的4 molL Nac和10%PEG(分子量6000,冰上放置60分钟。 12、4℃下1200g离心15分钟,沉淀用数m70%冰冷乙醇洗涤,4℃下12000g离心5分钟。 13、真空抽干沉淀,溶于500mlTE或水中 注意].提取过程中应尽量保持低温。 2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后操作应混和,切忌剧烈振荡 3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶利用RNA酶耐热的特性使用时应先对该酶液进行热处 理(80℃1小时)使DNA酶失活 (二)、 Hazard大量DNA纯化系统 碱法大量提取DNA往往需要很长的时间 Promega公司的 Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又 快速,只需要离心和真空抽干这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得lmg以上的高质量 的质粒DNA(200-2000p)。该系统不需要酚和氯仿抽提纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中,不 含任何盐份,可以直接用于DNA序列分析和酶切反应,也可以用于在核酸酶抑制剂(如 RNasin) 存在的条件下进行体外转录反应等 系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500m质粒培养液的分离和纯化试剂包括:150m细 胞悬浮液,150ml细胞裂解液,150m中和液,100 ml wizard大量DNA纯化树脂,125 ml wizard 柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。 1、100-500ml细胞培养液置离心管中,22-25℃下5000离心10分钟,所得细胞沉淀充分悬浮于 细胞悬浮液中。 2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡细胞裂解完全时, 溶液会变清,这一步需要20分钟 3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次,并使之混匀。 4、14000g,2225℃离心15分钟。 5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中 0.5倍体积的异丙醇混合均匀,14001922-25℃下离心15分钟。 7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2mT缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解 8、加10 ml wizard大量DNA纯化树脂溶液,并涡旋混合。 9、每一个样品,使用一支 Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上( Promega产品,与此配套) 将树脂DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂DNA混合液 11、将树脂灬NA混合液抽干后加13m柱子洗脱溶液至离心管中,对管底部的树脂/NA进行

5 3、同步骤 1 方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中,充分悬浮菌体细胞。 5、加入 12ml 新配制的溶液 II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴 10 分 钟。 6、加 9ml 用冰预冷的溶液 III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置 15 分钟,此时应形成白 色絮状沉淀。 7、4℃下 5000g 离心 15 分钟。 8、取上清液,加入 50ml RNA 酶 A(10mg/ml), 37℃水浴 20 分钟。 9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下 12000g 离心 10 分钟。 10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下 12000g 离心 10 分钟。 11、取上层水相,加入 1/5 体积的 4mol/L NaCl 和 10% PEG(分子量 6000), 冰上放置 60 分钟。 12、4℃下 12000g 离心 15 分钟, 沉淀用数 ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下 12000g 离心 5 分钟。 13、真空抽干沉淀，溶于 500ml TE 或水中。 [注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。 2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。 3. 由于 RNA 酶 A 中常存在有 DNA 酶,利用 RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处 理(80℃ 1小时),使 DNA 酶失活。 （二）、Wazard 大量 DNA 纯化系统 碱法大量提取 DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的 Wiazrd 大量 DNA 纯化系统既简单又 快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从 500ml 培养液中在 3 小时以内获得 1mg 以上的高质量 的质粒 DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的 DNA 溶于水或 TE 缓冲液中，不 含任何盐份，可以直接用于 DNA 序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如 RNasin） 存在的条件下进行体外转录反应等。 该系统中含有的试剂和柱子可以用于10 次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细 胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂，125ml Wizard 柱子洗脱溶液和 10 支 Wizard 带有存储离心管的柱子。 1、100-500ml 细胞培养液置离心管中, 22-25℃下 5000g 离心 10 分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于 细胞悬浮液中。 2、 加 15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时, 溶液会变清,这一步需要 20 分钟。 3、 加 15ml 中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。 4、 14000g,22-25℃离心 15 分钟。 5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。 6、 加 0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心 15 分钟。 7、 弃上清,悬浮 DNA 沉淀于 2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。 8、 加 10ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂溶液, 并涡旋混合。 9、每一个样品,使用一支 Wizard 大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套)。 10、将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。 11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加 13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行