《基因工程综合实验操作》讲义

基因工程综合实验操作 肠杆菌常规培养 大肠杆菌在LB( Luria- Bertani)液体培养基中,37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固 体培养基中,置于37℃培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素(Amp)抗性 基因质粒(如pUC18)的菌体,则需在培养基中加入100mgml的氨苄青霉素。在重组子克隆的 鉴定培养中,LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(X-gal), 浓度为40mgm,以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG),浓度为50mgml 大肠杆菌染色体DNA的抽提 1.大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时,6000pm,4℃,离心 10分钟收获菌体沉淀。 2.沉淀中加入36 ml buffer a(含溶菌酶5mg/ml),旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟 3.加入400mll0%SDS使最终浓度为1%,混匀,37℃保温30分钟或澄清即可 4.加入10m20mgml的PoK至最终浓度为1mgml,60℃保温60分钟 5.加入1m预先冷冻的5 molL Nacl至最终浓度为1moL,充分混匀后冰浴30分钟 6.4℃,15000mm,离心30min 7.取上清加入等体积(5m)的苯酚饱和溶液,充分混匀后4℃,15000mpm,离心30分钟 8.取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000pm,4℃,离心10分钟 9.取上清加入08V(4ml)异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上,4℃,15000mpm, 离心30分钟 10.弃上清,沉淀用3m170%的冰乙醇洗涤,4℃,15000mpm,离心5分钟。 11.弃上清,沉淀于37℃凉干后,用1 ml ddh2O溶解并移入 Eppendorf管中 2.取5ml电泳 Tris-HCl(pH8.0) EDTA (pH8.0) 20 mM DNA藤切 在 Eppendorf管中建立如下酶切反应体系:置于37℃保温1.5小时,然后电泳检查 质粒DNA 5 ml 限制性内切酶 10×酶切缓冲液1.5ml 无菌重蒸水 总体积 DNA琼脂糖凝胶电泳 1.用1×TAE-bufr配制0.7%的琼脂糖凝胶,在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2.待溶液冷却至60℃左右,加入溴化乙锭(用水配1mg/hml贮存液)至最终浓度为0.5 mg/ml, 充分混匀

基因工程综合实验操作 大肠杆菌常规培养 大肠杆菌在 LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养 12-16 小时。在 LB 固 体培养基中，置于 37℃ 培养箱培养 12-16 小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性 基因质粒（如 pUC18）的菌体，则需在培养 基中加入 100 mg/ml 的氨苄青霉素。在重组子克隆的 鉴定培养中，LB 固体培养基中还要加入特定的生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal）， 浓度为 40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为 50 mg/ml。 大肠杆菌染色体 DNA 的抽提 1. 大肠杆菌传一代后 30ml 液体 LB 培养基以 10%接种量培养 6 小时，6000rpm，4℃，离心 10 分钟收获菌体沉淀。 2. 沉淀中加入 3.6 ml Buffer A（含溶菌酶 5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温 30 分钟。 3. 加入 400 ml 10% SDS 使最终浓度为 1%，混匀，37℃保温 30 分钟或澄清即可。 4. 加入 10 ml 20 mg/ml 的 ProK 至最终浓度为 1 mg/ml，60℃保温 60 分钟。 5. 加入 1 ml 预先冷冻的 5 mol/L NaCl 至最终浓度为 1 mol/L，充分混匀后冰浴 30 分钟。 6. 4℃，15 000 rpm，离心 30min。 7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后 4℃，15000 rpm，离心 30 分钟。 8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后 13000 rpm，4℃，离心 10 分钟。 9. 取上清加入 0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后 -20℃放置 30 分钟以上，4℃，15000 rpm， 离心 30 分钟。 10. 弃上清，沉淀用 3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心 5 分钟。 11. 弃上清，沉淀于 37℃凉干后，用 1 ml ddH2O 溶解并移入 Eppendorf 管中。 12. 取 5 ml 电泳。 Buffer A Tris-HCl (pH8.0) 10 mM EDTA (pH8.0) 20 mM DNA 酶切 在 Eppendorf 管中建立如下酶切反应体系：置于 37℃保温 1.5 小时，然后电泳检查 质粒 DNA 5 ml 限制性内切酶 1 ml 10×酶切缓冲液 1.5 ml 无菌重蒸水 8.5 ml 总体积 15 ml DNA 琼脂糖凝胶电泳 1. 用 1×TAE–buffer 配制 0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2. 待溶液冷却至 60℃左右，加入溴化乙锭（用水配 1 mg/ml 贮存液）至最终浓度为 0.5 mg/ml， 充分混匀

用透明胶封固玻璃板两头,在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子,将温热的琼脂糖凝 胶倒入胶模中,凝胶厚度 在3-5mm之间 4.在凝胶完全凝固后,撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1×TAE- buffer的电泳槽中, 轻轻地拔去梳子,且使 缓冲液没过胶面约1mm 5.DNA样品与溴酚蓝混合后,用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中, 6.盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极(红线)移动。采用100V电压进行电泳 7.当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后(约半小时),切断电流,取出玻璃板,在紫外灯下观 查凝胶 50× TAE-buffer 242 冰醋酸 57.1ml EDTA 04g DIG分子杂交 I.DNA转移和固定 1.大肠杆菌染色体DNA(各1-2mg)分别用 BamHI、 EcoRI、Pst、 HindIII酶切,电泳 2.电泳拍照(胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位),搭建转移台,在盛有0.4 N NaOh 的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜(剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块)、凝胶 尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物,放置过夜。注:在摆放过程中要防止气泡的产生 3.次日取出尼龙膜,在槽口处用圆珠笔标记后,在6×SSC中洗涤306,放于牛皮纸上 于80℃烘2h,放入保鲜膜内于-20℃存放或立即杂交。 oligonucleo 1.用无菌水溶解 oligonucleotide至适当浓度 2.在插入冰中的管中混合 oligonucleotide 反应缓冲液(vall) CoCl2溶液(vial2) DIG-dUTP溶液(via3)1ml dATP溶液(via4) TdT (50units)(vial 5) I ml 加无菌水至终体积20ml 3.37℃保温15min,然后置于冰中,加入2m糖原溶液( I ml vial9+200ml02 MEDTA, 4.终止标记反应后,加入25m4 M LiCI,75ml乙醇(-20℃预冷),沉淀 oligonucleotide 5.至少在70℃放置30分钟或20℃放置2h,15000转/分离心20min。 6.沉淀用50m70%乙醇洗涤、晾干,用适当体积的无菌水溶解,保存于-20℃ I.预杂交和杂交

3. 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板 0.5-1.0 mm 的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝 胶倒入胶模中，凝胶厚度 在 3-5 mm 之间。 4. 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有 1×TAE-buffer 的电泳槽中， 轻轻地拔去梳子，且使 缓冲液没过胶面约 1 mm。 5. DNA 样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。 6. 盖上电泳槽并通电，使 DNA 向阳极（红线）移动。采用 100V 电压进行电泳。 7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观 查凝胶。 50×TAE-buffer Tris 242 g/l 冰醋酸 57.1 ml/l EDTA 0.4 g/l DIG 分子杂交 I．DNA 转移和固定 1. 大肠杆菌染色体 DNA（各 1-2 mg）分别用 BamHI、EcoRI、PstI、HindIII 酶切，电泳。 2. 电泳拍照（胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位），搭建转移台，在盛有 0.4N NaOH 的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜（剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块）、凝胶、 尼龙薄膜和卷筒纸及 500 克重物，放置 过夜。注：在摆放过程中要防止气泡的产生 3. 次日取出尼龙膜，在槽口处用圆珠笔标记后，在 6×SSC 中洗涤 30s，放于牛皮纸上， 于 80℃烘 2h，放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。 II．oligonucleotide tailing 1. 用无菌水溶解 oligonucleotide 至适当浓度。 2. 在插入冰中的管中混合： oligonucleotide 100pmol 反应缓冲液（vial 1） 4 ml CoCl2 溶液（vial 2） 4 ml DIG-dUTP 溶液（vial 3） 1 ml dATP 溶液（vial 4） 1 ml TdT（50units）（vial 5） 1 ml 加无菌水至终体积 20 ml。 3. 37℃保温 15min，然后置于冰中，加入 2 ml 糖原溶液（1 ml vial 9 + 200 ml 0.2M EDTA， pH8.0）。 4. 终止标记反应后，加入 2.5 ml 4M LiCl，75 ml 乙醇（-20℃预冷），沉淀 oligonucleotide。 5. 至少在-70℃放置 30 分钟或-20℃放置 2h，15000 转/分离心 20min。 6. 沉淀用 50 ml 70%乙醇洗涤、晾干，用适当体积的无菌水溶解，保存于-20℃。 III．预杂交和杂交

1.把尼龙膜放入杂交管中,按20m/100cm2加入预杂交液,于杂交炉中68℃保温至少 2.将DlG标记的DNA探针(5~25ng/m)煮沸10min,迅速插入盐冰中变性 3.弃此预杂交液,按25m00cm2膜加入含5-25ng/ml标记探针的杂交液 4.膜在杂交温度保温6-16hr。 5.在杂交温度洗涤: a至少50m00cm22×SSC,SDS,0.1%(W/) 5min2次 b0.1×SsC,SDS,0.1%(w/) 5min2次 6.膜可立即检测或晾干后保存。 免疫检测 1.杂交后严格洗涤,把膜直接浸入 Washing buffer中1-5mn。 2.在100 ml Blocking solution(1×conc)放置30min 3.用 Blocking Solution(1×Conc把anti-DG- AP conjugate稀释至50mUm,50ml中 有l0 ml anti-DIG-AP 4.膜在50m抗体溶液中放置30min。 5.100 ml Washing buffer洗膜l5min×2次 6.膜在20 ml Detection buffer中平衡2-5min 7.膜在新配的10 ml color- substrate solution中放置5min(置于黑暗中),注意在显色过 程中不要摇动 8.几分钟后有色物质开始生成,反应一般在1 9.颜色达到一定强度后,可用50mlH2O洗膜5min来终止反应 10.结果拍照保留 20×SSC 3 mol/ 0.3 mol/ pH7.0 Buffer 1 Maleic acid 0.1 mol/ Nacl 0.15mopH7.5固体NaOH调节 10× Blocking 溶于 Buffer I,灭菌后存于4℃ 杂交 Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交 使用前加入 polyA(val1l) N-lauroylsarkosine 终浓度为0.lmg/h 0.02% 2×预杂交液 用于DNA片段探针的杂交 2XSSC 使用时加入SDS,终浓度为0.5% Denhardts试剂 鮭鱼精子DNA碎片

1. 把尼龙膜放入杂交管中，按 20 ml/100 cm2 加入预杂交液，于杂交炉中 68℃保温至少 1 h。 2. 将 DIG 标记的 DNA 探针（5~25ng/ml）煮沸 10 min，迅速插入盐冰中变性。 3. 弃此预杂交液，按 2.5 ml/100 cm2 膜加入含 5-25 ng/ml 标记探针的杂交液。 4. 膜在杂交温度保温 6-16 hr。 5. 在杂交温度洗涤： a 至少 50 ml/100 cm2 2×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2 次 b 0.1×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2 次 6. 膜可立即检测或晾干后保存。 IV. 免疫检测 1. 杂交后严格洗涤，把膜直接浸入 Washing buffer 中 1-5 min。 2. 在 100 ml Blocking solution（1×conc）放置 30 min。 3. 用 Blocking Solution（1×Conc 把 anti-DIG-AP conjugate 稀释至 150 mU/ml，50 ml 中 有 10ml anti-DIG-AP conjugate）。 4. 膜在 50 ml 抗体溶液中放置 30 min。 5. 100ml Washing buffer 洗膜 15 min×2 次。 6. 膜在 20 ml Detection buffer 中平衡 2-5 min。 7. 膜在新配的 10 ml Color-substrate solution 中放置 5 min（置于黑暗中），注意在显色过 程中不要摇动。 8. 几分钟后有色物质开始生成，反应一般在 16 h 后达到完全。 9. 颜色达到一定强度后，可用 50 ml H2O 洗膜 5 min 来终止反应。 10. 结果拍照保留。 20×SSC NaCl 3 mol/l Na-citrate 0.3 mol/l pH 7.0 Buffer 1 Maleic acid 0.1 mol/l NaCl 0.15 mol/l pH 7.5 用固体 NaOH 调节 10×Blocking Blocking reagent 10% 溶于 Buffer 1，灭菌后存于 4℃ 杂交 Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交 5×SSC Blocking reagent 1% 使用前加入 polyA（vial 11） N-lauroylsarkosine 0.1% 终浓度为 0.1mg/ml SDS 0.02% 2×预杂交液 用于 DNA 片段探针的杂交 12×SSC 使用时加入 SDS，终浓度为 0.5% 10×Denhardts 试剂 鲑鱼精子 DNA 碎片 200 mg/ml

Tween 20 0.3% 加入Buer1中 Detection buffer Tris-HCI 显色中每10ml加入200u NaCl 0.1 mol/ NBT/BCIP stock solution MgCl2 50 mmol/ PCR法体外扩增phoA(碱性磷酸单脂基因) 1.按如下体积加入各反应物 体积 ddH20 20.5ml Mg2+(2.5mM) 5 ml d NTP (2. 5mM) Primer (10 pmol/mD) 染色体DNA(约100ng/ml) 5 ml ac酶(sUml) 0.5ml 2.充分混匀后按下列条件进行反应 97℃5min 95℃ 57℃1min30个循环 72℃2 72℃10min 3.取50%采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况,扩增产物集中于1.5kb片段的位置附近,割下 该位置的凝胶进行外源DNA的回收。 4.回收的PCR扩增产物直接与pMDl8-T载体连接,连接反应如下 PMD I8-T PCR产物 ∑ 5ml 5.16℃连接1h以上,用于转化。 DNA的琼脂糖凝胶回收 用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于 Eppendorf 管中,加入100ml重蒸水 2.用牙签将凝胶块尽量捣碎,剪去管的上部,用烧红的针头在管底扎几个微孔,孔径 越细越好

Washing Buffer Tween 20 0.3% 加入 Buffer 1 中 Detection buffer Tris-HCl 0.1 mol/l 显色中每 10ml 加入 200µl NaCl 0.1 mol/l NBT/BCIP stock solution MgCl2 50 mmol/l pH 9.5 PCR 法体外扩增 phoA（碱性磷酸单脂酶基因） 1. 按如下体积加入各反应物： 总体积 50 ml ddH2O 20.5 ml 10×buffer 5 ml Mg2+（2.5mM） 5 ml dNTP（2.5mM） 4 ml Primer1（10 pmol/ml） 10 ml Primer2（10 pmol/ml） 10 ml 染色体 DNA（约 100 ng/ml） 5 ml Taq 酶（5 U/ml） 0.5 ml 2. 充分混匀后按下列条件进行反应： 97℃ 5 min 95℃ 30 s 57℃ 1 min 30 个循环 72℃ 2 min 72℃ 10 min 4℃ ∞ 3. 取 50％采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况，扩增产物集中于 1.5 kb 片段的位置附近，割下 该位置的凝胶进行 外源 DNA 的回收。 4. 回收的 PCR 扩增产物直接与 pMD18-T 载体连接，连接反应如下： Solution I PMD18-T PCR 产物 ∑ 5 ml 1 ml 4 ml 10 ml 5. 16℃连接 1h 以上，用于转化。 DNA 的琼脂糖凝胶回收 1. 用手术刀在 DNA 紫外检测仪下切割下含有所要 DNA 片段的凝胶块置于 Eppendorf 管中，加入 100 ml 重蒸水。 2. 用牙签将凝胶块尽量捣碎，剪去管的上部，用烧红的针头在管底扎几个微孔，孔径 越细越好

将管套入另一个 Eppendorf管中,常温下,15000rpm离心10分钟。 4.将上清液吸到收集管中,向沉淀中加入100ml重蒸水。 重复步骤(2)、(3)、(4)各一次,见图 6.收集的上清液加入0.V的KAc(PH55,3M)和20-25V的无水乙醇,充分混匀 后20℃放置30min,取 出15000rpm,4℃离心30mi 7.弃上清,加入400m70%的乙醇,15000pm,4℃离心5min。 8.弃上清,沉淀凉干后用20 ml ddh2O溶解待用 大肠杆菌感受态细胞的制备 1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上,37℃下隔夜培养。 2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中,37℃C下隔夜培养。 3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mLB培养基 4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时,OD600接近0.5 5.4℃,6000mpm离心10分钟收获菌体 6.上述得到的菌体沉淀用10m的10 mmol/L cacl2(冰冻)悬浮,4℃,6000mpm离心 10分钟。 7.弃上清,将沉淀用1ml的7 mmo l CaC(冰冻)重新悬浮并转入无菌 Eppendorf管 8.冰水浴中放置8h即可使用。 大肠杆菌的转化 1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。 2.吸取90m感受态细胞悬浮液至无菌 Eppendorf管中,加入10mDNA溶液,轻轻混匀, 在冰水浴中放置30分钟 3.42℃水浴中脉冲2分钟,快速转移至冰水浴中,加入900mLB培养基,37℃水浴摇床 培养1-1.5小时 4.吸取100ml已转化的感受态细胞涂布于100mg/mAp和40mg/mlx-gal的LB平板上。 5.37℃下倒置培养12-16小时,挑选单菌落划线扩增培养。 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA 1.在 Eppendorf管中加入110m的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/hml)溶液 挑入米粒大小的菌团,充 分悬浮并混匀 2.上述菌体悬浮液沸水煮30秒 3.迅速放置于常温下15000pm离心15分钟。 4.用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇,充分混匀后4℃ 15000rpm离心20分钟。 5.弃上清液,加入70%冰乙醇400ml,4℃,15000mpm离心5分钟

3. 将管套入另一个 Eppendorf 管中，常温下，15000 rpm 离心 10 分钟。 4. 将上清液吸到收集管中，向沉淀中加入 100 ml 重蒸水。 5. 重复步骤(2)、(3)、(4)各一次，见图。 6. 收集的上清液加入 0.1V 的 KAc（PH5.5，3M）和 2.0-2.5 V 的无水乙醇，充分混匀 后-20℃放置 30 min，取 出 15000 rpm，4℃离心 30 min。 7. 弃上清，加入 400 ml 70％的乙醇，15000rpm，4℃离心 5 min。 8. 弃上清，沉淀凉干后用 20 ml ddH2O 溶解待用。 大肠杆菌感受态细胞的制备 1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于 LB 固体培养基上，37℃下隔夜培养。 2. 挑取单菌落接种于 30 ml LB 液体培养基中，37℃下隔夜培养。 3. 按 1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于 30 ml LB 培养基中。 4. 在 37℃的水浴摇床中培养 1.5 小时，OD600 接近 0.5。 5. 4℃，6000 rpm 离心 10 分钟收获菌体。 6. 上述得到的菌体沉淀用 10 ml 的 10 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，4℃，6000 rpm 离心 10 分钟。 7. 弃上清，将沉淀用 1 ml 的 75 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮并转入无菌 Eppendorf 管 中。 8. 冰水浴中放置 8 h 即可使用。 大肠杆菌的转化 1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。 2. 吸取 90 ml 感受态细胞悬浮液至无菌 Eppendorf 管中，加入 10 ml DNA 溶液，轻轻混匀， 在冰水浴中放置 30 分钟。 3. 42℃水浴中脉冲 2 分钟，快速转移至冰水浴中，加入 900 ml LB 培养基，37℃水浴摇床 培养 1-1.5 小时。 4. 吸取 100 ml 已转化的感受态细胞涂布于 100 mg/ml Ap 和 40 mg/ml X-gal 的 LB 平板上。 5. 37℃下倒置培养 12-16 小时，挑选单菌落划线扩增培养。 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒 DNA 1. 在 Eppendorf 管中加入 110 ml 的 STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为 5 mg/ml）溶液， 挑入米粒大小的菌团，充 分悬浮并混匀。 2. 上述菌体悬浮液沸水煮 30 秒。 3. 迅速放置于常温下 15000 rpm 离心 15 分钟。 4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入 100 ml 的异丙醇，充分混匀后 4℃， 15000 rpm 离心 20 分钟。 5. 弃上清液，加入 70%冰乙醇 400 ml，4℃，15000 rpm 离心 5 分钟