洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液),并加入柱子中。 12、真空抽干所加入的洗脱 13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干 14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的树脂,柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管 中2500pm(1300g)离心5分钟。 15、取出柱子,真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中,2500pm(1300g)离 5分钟 16、在柱子中加入1.5m65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子 离心管5分钟。 17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中盖上盖子,储存在 4℃或-20℃备用 注意]1.在使用之前系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125m95%乙醇。 2.纯化树脂必须混匀后再用 (三)、 Sephrose2B柱纯化质粒DN 碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的 DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用 Sepharose2B或 Sepharose4B进行纯化该方法具有快 速条件温和,重复性好载体物质可以再利用等优点因而已广泛用于质粒DNA纯化。 1、将 Sepharose2B经含0.1%SDS的TE(pH80)平衡后上柱。 2、将至多1m的DNA溶液铺在 Separase2B柱上。 3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1%SDS的TE(pH8.0)贮液瓶 4、以lml流出液为1份进行收集 5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第 一个峰中 6、合并所有含质粒的洗脱液用等体积的酚氯仿(1)抽提,4℃下12000g离心2分钟将上层水 相转入新管。 7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇,20℃下沉淀10分钟然后4℃下12000g离心10分钟弃去 上清液 8、沉淀加70%乙醇洗涤4℃下12000g离心10分钟弃去上清液 9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。 注意]在装柱过程中要防止柱床中出现断裂或气泡现象要使界面保持平整。对新装成的柱,应 用含0.1%SDS的TE平衡,以使柱内的凝胶均匀 思考题 1.质粒的基本性质有哪些? 2.质粒载体与天然质粒相比有哪些改进? 3.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题? 第二章DNA酶切及凝胶电泳 第一节概述
6 洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。 12、真空抽干所加入的洗脱。 13、 再加 12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。 14、 加入 5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管 中,2500rpm(1300g)离心 5 分钟。 15、 取出柱子，真空抽干 5 分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离 心 5 分钟。 16、在柱子中加入 1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或 TE,1 分钟后 2500rpm(1300g)离心柱子/ 离心管 5 分钟。 17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒 DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在 4℃或-20℃备用。 [注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按 1:1 加入 125ml 95％乙醇。 2. 纯化树脂必须混匀后再用. （三）、Sephrose 2B 柱纯化质粒 DNA 碱法提取的质粒 DNA 即使用 RNA 酶处理,仍会含有少量 RNA。当有些试验需无 RNA 污染的 DNA 制品时,则需进行进一步纯化。一般常用 Sepharose 2B 或 Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快 速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒 DNA 纯化。 1、将 Sepharose 2B 经含 0.1% SDS 的 TE（pH8.0）平衡后上柱。 2、将至多 1ml 的 DNA 溶液铺在 Sepharase 2B 柱上。 3、待 DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有 0.1% SDS 的 TE(pH8.0)贮液瓶。 4、以 1ml 流出液为 1 份进行收集。 5、对每一管测定其 OD260 值,以确定哪些管中含有质粒 DNA。通常质粒 DNA 在柱上流出的第 一个峰中。 6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下 12000g 离心 2 分钟,将上层水 相转入新管。 7、加入 2 倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀 10 分钟,然后 4℃下 12000g 离心 10 分钟,弃去 上清液。 8、沉淀加 70%乙醇洗涤,4℃下 12000g 离心 10 分钟,弃去上清液。 9、 沉淀真空抽干,重新溶于 TE 或无菌水中。 [注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应 用含 0.1% SDS 的 TE 平衡, 以使柱内的凝胶均匀。 思考题 1. 质粒的基本性质有哪些？ 2. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？ 3. 在碱法提取质粒 DNA 操作过程中应注意哪些问题？ 第二章 DNA 酶切及凝胶电泳 第一节 概 述
DNA的限制性内切切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异 位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于ATP的存在。I类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类 酶在识别位点上切割DNA分子然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶 (限制酶)它切割某一特异的核苷酸序列,另一种为独立的甲基化酶它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的 限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别 长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列如EoRI识别六个核苷酸序列5-G」ATTC-3) 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中有的在对称轴处切割产生平 末端的DNA片段(如SmaI:5- CCCIGGO-3),有的切割位点在对称轴一侧产生带有单链突出末端的 DNA片段称粘性未端,如 EcoR I切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5.G」 AATTC..3→5.. GAATTC..3 3. CTTAATG…5→3.. CTTAA G.5 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限 制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时会影响 其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必 须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液则可同时水解。若需要不同的盐浓度 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也 可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚氯仿抽提,加0.1倍体积3 molL naAc和2倍体积无水乙 醇,混匀后置-π0℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶 酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的 RFLP限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多 种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对 位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为05-1吗。限制性 内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37℃)。对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1吗gDNA加1单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速 可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料 溴化乙啶( Ethidium bromide,EB)染色在紫外光下至少可以检出1-lng的DNA条带,从而可以确定 DNA片段在凝胶中的位置。此外还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带用于以后的克隆 操作
7 一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异 位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类 酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶 (限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的 限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别 长度为4至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平 末端的 DNA 片段(如 SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限 制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响 其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必 须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度, 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也 可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶 酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多 种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对 位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为 0.5-1μg。限制性 内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶,消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加 2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二. 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速， 可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出 1-10ng 的 DNA 条带,从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带,用于以后的克隆 操作
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围 较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在 和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高甚至 相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作 比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板 凝胶电泳装置进行DNA电泳 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定 1、DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大 则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁 移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于05kb的 DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为03-07%,DNA片段大 小间于两者之间则所需胶浓度为08-1.0%。 3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关还和它本身构象有关。相 同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快, 而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒 DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种 限制性内切酶分别水解,然后电泳如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA 4、电源电压 在低电压时线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分 子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长片段越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2Kb的DNA片段的分辨率达到最 大所加电压不得超过5vm 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状 和带缺口的环状DNA,使其刚性更强还会使线状DNA迁移率降低15%。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配 制凝胶),电导率最小DNA几乎不移动在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很 高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性 对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE含EDTA(pH!.0)和Tris-乙酸]TBE(Tri 硼酸和EDIA,TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温 第二节材料、设备及试剂 材料 λDNA:购买或自行提取纯化;重组pBS质料或pC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液:购买成
8 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围 较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在 强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至 相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作 比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板 凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。 琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反比，分子越大 则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁 移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 DNA 分子的大小。分离小于 0.5kb 的 DNA 片段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于 10kb 的 DNA 分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA 片段大 小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1.0%。 3、 DNA 分子的构象 当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相 同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋 DNA 移动最快, 而线状双链 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种 限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。 4、 电源电压 在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分 子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最 大,所加电压不得超过 5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状 和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强,还会使线状 DNA 迁移率降低 15％。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配 制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加 10×电泳缓冲液),则电导很 高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE[含 EDTA (pH8.0)和 Tris-乙酸],TBE(Tris- 硼酸和 EDTA),TPE(Tris-磷酸和 EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。 第二节 材料、设备及试剂 一、 材料 λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组 pBS 质料或 pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成
品;Hind酶及其酶切缓冲液:购买成品;琼脂糖( Agarose)进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、设备 水平式电泳装置,电泳仪台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射 仪,照相支架,照相机及其附件 三、试剂 1、5×TBE电泳缓冲液:配方见第一章。 2、6×电泳载样缓冲液:0.25%溴粉蓝,40%(w)蔗糖水溶液,贮存于4℃。 3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将BB配制成10mgm用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 第三节操作步骤 DNA切反应 1、将清洁干燥并经灭菌的ε bendorf管(最好θ.5m)编号,用微量移液枪分别加入 DNA lug和 相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2山再加入重蒸水使总体积为19山将管内溶液混匀后加入1u 酶液用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实 验成败的关键要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降 2、混匀反应体系后将 eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保 温2-3小时,使酶切反应完全。 3、每管加入2山l0. I moVL EDTA(pH!.0,混匀,以停止反应置于冰箱中保存备用。 二、DNA分子量标准的制备 采用 EcoR I或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准DNA为长度约50kb 的双链DNA分子,其商品溶液浓度为05mgm,酶解反应操作如上述。Hind切割DNA后得到8 个片段长度分别为231,9.4,66,44,23,20,0.56和0.12kb。 EcoRI切割DNA后得到6个片段,长 度分别为21.2,74,58,56,49和2kb。 三、琼脂糖凝胶的制备 1、取5×TBE缓冲液20m加水至20om配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用 2、胶液的制备:称取04g琼脂糖,置于200m锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入 微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时 摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜以减少水份蒸发 3、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约lcm)紧密封住。将封好的胶槽置于 水平支持物上插上样品梳子注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5ghm《也可不把EB 加入凝胶中而是电泳后再用0.sψgml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶 封橡皮膏内侧待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒 胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀速度也不可太快否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳 子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 因边缘效应样品槽附近会有一些隆起阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓 冲液 4、加样:取loμ酶解液与2μ6×载样液混匀用微量移液枪小心加λ样品槽中。若DNA含量 偏低则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换ip头,以防
9 品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、 设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射 仪, 照相支架, 照相机及其附件。 三、 试剂 1、 5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将 EB 配制成 10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。 第三节 操作步骤 一、 DNA 酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管(最好 0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入 DNA 1μg 和 相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl,再加入重蒸水使总体积为 19μl,将管内溶液混匀后加入 1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实 验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降 低。 2、 混匀反应体系后,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保 温 2-3 小时,使酶切反应完全。 3、 每管加入 2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 二、DNA 分子量标准的制备 采用 EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA 为长度约 50kb 的双链 DNA 分子,其商品溶液浓度为 0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII 切割 DNA 后得到 8 个片段,长度分别为 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和 0.12kb。EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 个片段,长 度 分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb。 三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取 5×TBE 缓冲液 20ml 加水至 200ml,配制成 0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖,置于 200ml 锥形瓶中,加入 50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入 微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时 摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于 水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙。 向冷却至 50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为 0.5μg /ml(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶 封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒 胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳 子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入 0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓 冲液。 4、 加样：取 10μl 酶解液与 2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若 DNA 含量 偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换 tip 头,以防
止互相污染注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿 5、电泳:加完样后合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5ggml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或己加有EB的电泳胶板。 DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩, 以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶 片,光圈56曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择) 8、DNA分子量标准曲线的制作:在放大的电泳照片上以样品槽为起点用卡尺测量DNA的 EcoR I和Hind酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标以迁移距离 为横坐标在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线 9、DNA酶切片段大小的测定:在放大的电泳照片上用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离 根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值进一步计算出各片段的分子量大小(若用 单对数坐标纸来绘制标准曲线则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片 段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离 10、DNA酶切片段排列顺序的确定:根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环 状图或直线图表示即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 注意]酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应 2、酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:在最适反应条件下,1小时完全降解1mg IDNA的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA不象DNA那样易于降解,需适当增加酶的使 用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应 3、市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释 另外,酶通常保存在50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在Ⅵ10之下,否则,酶 活性将受影响。 4、观察DNA离不开紫外透射仪可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA 5、EB是强诱变剂并有中等毒性配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃 6、当EB太多胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡30分钟后再观察。 思考题 1.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因? 2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响? 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中 般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如
10 止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在 60-80V,电流在 40mA 以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时,停止电泳。 6、 染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中,室温下染色 20-25 分钟。 7、 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 EB 的电泳胶板。 DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩, 以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶 片，光圈 5.6,曝光时间 10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择)。 8、 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量 λDNA 的 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离 为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下 DNA 分子量的标准曲线。 9、 DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出 DNA 样品各片段的迁移距离, 根据此数值,在 DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用 单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出 DNA 片段的大小)。反之,若已知 DNA 片 段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 10、 DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照 DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环 状图或直线图表示,即成该 DNA 分子的限制性内切酶图谱。 [注意] 1.酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解 1mg lDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的 DNA 不象 lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使 用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。 另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下，否则，酶 活性将受影响。 4、 观察 DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA 分子有切割作用。从胶上回收 DNA 时, 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割 DNA。 5、EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。 凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、 当 EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后再观察。 思考题 1. 如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被切动, 你认为可能是什么原因？ 2. 琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？ 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节 概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中, 一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如