冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的lx 层析柱加样溶液。 5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲 以1/3至12柱床体积分管收集洗脱液 6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。 7、加入1/10体积的3 NAaC(pH52),25倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟 8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000离心5 分钟 9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟 10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于70℃)。 注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上 2、 oligo(d)纤维素柱用后可用0.3 mol/l naoH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入 0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱 第三节植物病毒RNA提取 大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简 单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 、材料 提纯TMV病毒液(10mg/ml) 设备 冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。 三、试剂 TE-饱和酚氯仿(1:1),氯仿,3 NAaC(pH5.2),乙醇(100%和70%),T缓冲液,无RNA酶 的双菌水 四、操作步骤 endorf管加入提纯TM(lomg/ml)400ml,再加入等体积酚氯仿,盖紧管盖后用手 充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟 2、吸取水相于一新 eppendorf管,再用酚氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止 3、吸取水相于新 eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离 心10分钟。 4、取水相,加入1/10倍体积的3 molL NaAc(pH52),25倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30 5、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5 6、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或 TE缓冲液中 取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成 注意]1、整个操作应尽可能在低温下进行。 2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚
16 冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有 RNA 溶液进入柱床后，加入 1 倍柱床体积的 1x 层析柱加样溶液。 5、测定每一管的 OD260，当洗出液中 OD 为 0 时，加入 2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液， 以 1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。 6、测定 OD260，合并含有 RNA 的洗脱组分。 7、加入 1/10 体积的 3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30 分钟。 8、4℃下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下 12000g 离心 5 分钟。 9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥 10 分钟，或真空干燥 10 分钟。 10、用少量水溶解 RNA 液，即可用于 cDNA 合成（或保存在 70%乙醇中并贮存于-70℃）。 [注意] 1、mRNA 在 70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 2、oligo(dT)纤维素柱用后可用 0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入 0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用 NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱 床。 第三节 植物病毒 RNA 提取 大多植物病毒 RNA 为单链 RNA，并且其极性与 mRNA 极性相同，植物病毒 RNA 提取较为简 单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 一、材料 提纯 TMV 病毒液（10mg/ml）。 二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和 70%)，TE 缓冲液，无 RNA 酶 的双菌水。 四、操作步骤 1、取一 eppendorf 管加入提纯 TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手 充分振荡 1 分钟，4℃下 12000g 离心 10 分钟。 2、吸取水相于一新 eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3、吸取水相于新 eppendorf 心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下 12000g 离 心 10 分钟。 4、取水相，加入 1/10 倍体积的 3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30 分钟。 5、4℃下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀，4℃下 12000g 离心 5 分钟。 6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥 5 分钟或空气干燥 10 分钟，并溶于无 RNA 酶的双菌水或 TE 缓冲液中。 7、取 10ml 进行电泳分析，另 10ml 用于 cDNA 合成。 [注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。 2、由于病毒 RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚
氯仿的抽提 第四节cDNA合成技术 Riboclone m-mⅤ(H-)cDNA合成技术 Promega公司的 RibocloneR m-MLv(H-)cDNA合成系统采用MMLV反转录酶的 RNase h缺 失突变株取代AMV反转录酶使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用MMIV反转录 酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用 RNasel和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4DNA 聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括: 20ug特异性引物 200μMMLV第一链缓冲液(5×),配方如下:250 mmolL Tris Cl pH8.3(37℃时),375 mmol/ Kcl 15 mmol/L MeC2;50 mmoL/L DTt.,1 Ommon/L dATP,dCTP,dGTP,dTTP混合物(各2.5mmol) 2×625μrRNa 10,000 IM-MLV反转录酶, RNase h 5g对照RNA 400 ul M-MLv第二链缓冲液(10×),配方如下: 400mmol Tris Cl, pH7. 2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgC12 30mmol/L DTT, 0. 5mg/ml BSA 500u RNase 500uDNA聚合酶I 100uT4DNA聚合酶I 2×1.25ml不含核酸酶的水 以上所有试剂除对照RNA需在70℃保存外其余均可保存于20℃,可以合成40 g mRNA (一)第一链合成 1.试剂 [a-32P]dCTP(>400 Ci/mmol),EDTA(50mM和200mM),TE饱和酚氯仿(1:1),7.5MNH4Ac 乙醇(100%和70%),TE缓冲液。 2.操作步骤 (1)取一灭菌的无RNA酶的 eppendorf管加入RNA模板和适当引物,每吗RNA使用0.5ug引 物(如使用NotI引物接头,使用0.3g,用H2O调整体积至15μ,70℃处理5分钟冷却至室温,离心使 溶液集中在管底再依次加入 5×第一链缓冲液su rNAsin rna酶抑制剂25U MMIV(H-)反转录酶200U H2O调至总体积25u (2)用手指轻弹管壁吸取5园至另一 eppendorf管,加入2-5gCi[a-32P]dCTP(400Cimo), 用以第一链同位素掺入放射性活性测定 (3)37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时 (4)取出置于冰上 (5)掺入测定的 eppendorf管加入95μ50 mM EDTA终止反应并使总体积为100ul。可取9ou
17 /氯仿的抽提。 第四节 cDNA 合成技术 一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技术 Promega 公司的 RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系统采用 M-MLV 反转录酶的 RNase H 缺 失突变株取代 AMV 反转录酶,使合成的 cDNA 更长。该系统的第一链合成使用 M-MLV 反转录 酶,cDNA 第二链合成采用置换合成法,采用 RNaseH 和 DNA 聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用 T4 DNA 聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括： 20μg 特异性引物 200μl M-MLV 第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各 2.5mmol/L) 2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制剂 10,000μ M-MLV 反转录酶, RNase H- 5μg 对照 RNA 400μl M-MLV 第二链缓冲液(10×)，配方如下： 400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。 500μ RNase H 500μ DNA 聚合酶Ⅰ 100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ 2×1.25ml 不含核酸酶的水 以上所有试剂除对照 RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成 40μg mRNA。 （一） 第一链合成 1. 试剂 [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和 200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac， 乙醇(100%和 70%)，TE 缓冲液。 2. 操作步骤 (1) 取一灭菌的无 RNA 酶的 eppendorf 管,加入 RNA 模板和适当引物,每 μg RNA 使用 0.5μg 引 物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用 H2 O 调整体积至15μl, 70℃处理 5 分钟,冷却至室温,离心使 溶液集中在管底,再依次加入 5×第一链缓冲液 5μl rRNasin RNA 酶抑制剂 25U M-MLV(H- )反转录酶 200U H2 O 调至总体积 25μl (2) 用手指轻弹管壁,吸取 5μl 至另一 eppendorf 管，加入 2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol), 用以第一链同位素掺入放射性活性测定。 (3) 37℃(随机引物)或 42℃(其它引物)温浴 1 小时 (4) 取出置于冰上 (5) 掺入测定的 eppendorf 管加入 95μl 50mM EDTA 终止反应,并使总体积为 100μl。可取 90μl
进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10u进行同位素掺入放射性活性测定。 (6)第一链合成 eppendorf管可直接用于第二链合成 注:以上2山反应总体积中所用RNA量为lgg,如合成5gRNA,则可按比例扩大反应体积,倒 5 ug RNA使用125u总体积进行合成 二)第二链合成 1、取第一链反应液20μ,再依次加入 10×第二链缓冲液20u DNA聚合酶I23u RNaseh0.8μ H2O加至终体积为100 2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μ至另一 eppendorf管,加入 2-5u Ci[a-32 P]dcTP 3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA,则需延长至3-4小时)。 4、掺入测定 eppendorf管中加入9opl50 MM EDTA,取10μd进行同位素掺入放射性测定余下 的可进行电泳分析。 5、cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟,低速离心后置冰上。 6、加入2uT4DNA聚合酶,37℃温浴10分钟 7、加入10μd200 mmol/L EDTA终止反应。 8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。 9、水相移至另一 eppendorf管加入0.5倍体积的75M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,p5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分钟后离心5分钟 10、小心丢去上清液加入05m冰冷的70%乙醇,离心2分钟。 11、小心移去上清液干燥沉淀。 12、沉淀溶于10-20uT缓冲液 三)同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析 1.试剂 lmg/ml鮭鱼精DNA,三氯乙酸(ICA,5%和7%),碱性琼脂糖胶,碱性胶电泳缓冲液,(30mM NaOH,1 mM EDTA),2×样品缓冲液,(20 mM NaOH,20%甘油,0.025%溴酚蓝)。 2.操作步骤 (1)各取一2(5)中和二(4)反应液各3μ,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥,这些样品代表总放射性活 性 尝(2)同样各取中反应液至含有100(1mngm鮭鱼精DNA中,混匀加入05ml5%TCA,涡旋 合仪混合后置冰上5-30分钟 (3)用玻璃纤维滤纸过滤用冰冷的5%TCA洗三次每次用5 MI TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性 (4)分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度可用盖革计算器,也可用液闪计数。 3.第一链产量测定
18 进行电泳分析(先用苯酚抽提),另 10μl 进行同位素掺入放射性活性测定。 (6) 第一链合成 eppendorf 管可直接用于第二链合成 注：以上 25μl 反应总体积中所用 RNA 量为 1μg,如合成 5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒 5μg RNA 使用 125μl 总体积进行合成。 （二） 第二链合成 1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入 10×第二链缓冲液 20μl DNA 聚合酶Ⅰ23μ RNase H 0.8μ H2O 加至终体积为 100μl 2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出 10μl 至另一 eppendorf 管,加入 2-5μCi[α-32 P] dCTP。 3、14℃温浴 2 小时(如需合成长于 3kb 的 cDNA, 则需延长至 3-4 小时)。 4、 掺入测定 eppendorf 管中加入 90μl 50mM EDTA, 取 10μl 进行同位素掺入放射性测定,余下 的可进行电泳分析。 5、 cDNA 第二链合成离心管反应液 70℃处理 10 分钟, 低速离心后置冰上。 6、 加入 2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃温浴 10 分钟。 7、加入 10μl 200mmol/L EDTA 终止反应。 8、用等体积酚:氯仿抽提 cDNA 反应液,离心 2 分钟。 9、水相移至另一 eppendorf 管,加入 0.5倍体积的7.5M 醋酸铵(或 0.1 倍体积的 1.5M 醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入 2.5 倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置 30 分钟后离心 5 分钟。 10、 小心丢去上清液,加入 0.5ml 冰冷的 70%乙醇,离心 2 分钟。 11、 小心移去上清液,干燥沉淀。 12、 沉淀溶于 10-20μl TE 缓冲液。 （三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析 1. 试剂 1mg/ml 鲑鱼精 DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和 7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。 2. 操作步骤 (1) 各取一 2(5)中和二(4)反应液各 3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活 性。 (2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA 中,混匀,加入 0.5ml 5% TCA, 涡旋 混合仪混合后置冰上 5-30 分钟。 (3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的 5% TCA 洗三次,每次用 5ml TCA,再用 5ml 丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。 (4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。 3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%严掺入cpm总cpm×100% 掺入dNTP(nmo)=2 nmol dNTP/×反应体积(μ)×(第一链掺入率 设330为每 mol dNTP的平均分子量 合成CDNA量(ng=掺入dNTP(mmo)×330ng/mmol RNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng)/模板RNA量(ng)×100% 例如总放射性活性强度为254,000m,掺入放射性活性强度为3040cpm,所用RNA摸板量为 lg反应体积为25u,则: 掺入率=3040254000×100%=1.2 掺入dNTP量=2 nmol dNTP仙×25×1.2%=06nmol 合成cDNA量=0.6 nmol dNTP×330 ng/nmol=198ng mRNA向cDNA转变率=198nm1000ng×100%19.8% 由于1000gRNA中20%(5山/25u山)用于掺入测定而反应体积占总体积80%,因而实际第一链 cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。 4.第二链产量计算 除需去除第一链掺入dNIP外,方法同第一链产量计算 第二链掺入率=掺入放射性活性/总放射性活性?? 掺入dNTP量(no)=[04 nmol dNTP/ul×反应体积山)一第一链掺入nmo]第二链掺入率 第二链cDNA合成量(ng= nmol dNTP×330ng/hmol 双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ngy单链cDNA合成量(ng) 例:第二链掺入放射性活性强度为2780cmp,总放射性活性强度为235000m 第二链掺入率=2780235000×100%=1.18% 第二链合成dNTP量=(0.4 modul×100u)-048nm]×1.18%=0.47hmol 合成第二链cDNA量(ng=0.47nmol×30 ng/nmol=l55ng 双链cDNA转变率=15sng/58ngx100%=98% 般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。 (四)电泳分析 通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行14%碱性琼脂糖电泳。将第 链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀,方法见本章(二)第二链合成中的9-12 步,一般第一链和第二链上样量相同 1.标准分子量DNA参照物的同位素标记 (1)通常使用ADNA/HindⅢ片段,用 Klenow dNa聚合酶进行32P标记 10×Hind缓冲液2.5μl dATPO.2mmoIL dG tP 0. 2mmol/L Ia-32 PldcTP(400Ci/mmol) 2u Ci λ DNA/HindI标准 DNA lug Klenow dNA聚合酶lu 加HO到总体积25μ
19 第一链掺入率(%)= 掺入 cpm/总 cpm ×100% 掺入 dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率) 设 330 为每 mol dNTP 的平均分子量 合成 cDNA 量(ng)=掺入 dNTP (nmol)×330ng/nmol mRNA 向 cDNA 转变率=合成 cDNA 量(ng) / 模板 RNA 量(ng)×100% 例如总放射性活性强度为 254,000cpm, 掺入放射性活性强度为 3040cpm, 所用 RNA 摸板量为 1μg,反应体积为 25μl, 则: 掺入率＝3040/254000×100%=1.2 掺入 dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol 合成 cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng mRNA 向 cDNA 转变率=198nm/1000ng×100%=19.8% 由于 1000ng RNA 中 20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积 80%,因而实际第一链 cDNA 合成量为 0.8×198ng=158ng。 4. 第二链产量计算 除需去除第一链掺入 dNTP 外,方法同第一链产量计算 第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性?? 掺入 dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入 nmol]×第二链掺入率 第二链 cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol 双链 cDNA 转变率=双链 cDNA 合成量(ng)/ 单链 cDNA 合成量(ng) 例: 第二链掺入放射性活性强度为 2780cmp, 总放射性活性强度为 235000cpm. 第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18% 第二链合成 dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol 合成第二链 cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng 双链 cDNA 转变率=155ng /158ng×100%=98% 一般 cDNA 第一链转变率和双链转变率以 12-50%和 50-200%为好。 （四） 电泳分析 通常合成的 cDNA 第一链和第二链长度为 350-6000 碱基,需进行 1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一 链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的 9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。 1. 标准分子量 DNA 参照物的同位素标记 (1) 通常使用 λDNA/HindⅢ片段,用 Klenow DNA 聚合酶进行 32 P 标记 10×HindⅢ缓冲液 2.5μl dATP 0.2mmol/L dGTP 0.2mmol/L [α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi λDNA/HindⅢ标准 DNA 1μg Klenow DNA 聚合酶 1μ 加 H2O 到总体积 25μl
(2)室温放置10分钟,加25200 MMEDTA终止反应,加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。 2.电泳分析 (1)用5 OmM Nacl, ImM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳,并置碱性电泳缓冲液中30分钟 (2)取样品液,用TE调整体积,使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样 品缓冲液(20 mmol/L NaOH,20%甘油,0.025%溴粉兰)。 (3)加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳缓冲液为30 mmol/L NaOH, lmmol/L EDTA。 (4)将胶浸入7%TCA中室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色,取出置滤纸上干燥数小 时 (5)用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压ⅹ光片(用增感屏时-70℃压片) 其它CDNA合成技术 除 Riboclone m-mlv(H-)CDNA合成技术外, Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒,不 同试剂盒所提供的引物或引物一延接头( Primp- Adaptor)不同,有 oligo(dTl5引物、随机引物、XbaI 引物延接头、NotI引物延接头等,其余试剂一样,这些系统包括 0mg引物 20ml5x第一链缓冲液,配方如下: 250mmol/L Tris- CL pH8.3(42 C); 250mmol/L KCl; 50mmol/L MgC2,2 5mmol/L亚精胺( Spermidine,s0 mmol/L DT 20mmol/L datP, dctP, dGTP, dTTP(& 5mmol/L) 50ml40mM焦碳酸钠 625 m rNAsin rna酶抑制剂 600mAMV反转录酶 5mg1.2kb对照RNA 200ml10x第二链缓冲液,配方如下 400mmol/L Tris CL pH7. 2: 900mmol/L KCl; 30mmol/L MgCI2; 30mmolL DTT, 0.5mg/ml BSA 2m E Coli RNaseh 500m E. ColiDNA Polymerase I 100m T4 DNA Polymerase I 15ml不含核酸酶的水 以上所有试剂除对照RNA需在70℃保存外,其余均可保存于20℃,可以合成40 mgmRNA (-)第一链合成 下面介绍的是25ml体积反应系统,该系统可合成多至2 mgmRNA,每增加 Img mRNA,需增 加反应体积10m,如5 mg mRNA需55m反应体积 引物或引物延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为05mgmg(对NotI引物-延接头 为0.3mgmg)和15m/mg 1、试剂
20 (2) 室温放置 10 分钟, 加 2.5μl 200mM EDTA 终止反应, 加入 2×样品缓冲液,贮存于-20℃。 2. 电泳分析 (1) 用 50mM NaCl, 1mM EDTA 制备 1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中 30 分钟。 (2) 取样品液, 用 TE 调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的 2×样 品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。 (3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的 1/3 处，电泳缓冲液为 30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。 (4) 将胶浸入 7% TCA 中,室温放置 30 分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小 时。 (5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压 X 光片(用增感屏时-70℃压片)。 二、其它 cDNA 合成技术 除 Riboclone M-MLV(H-)cDNA 合成技术外，Promega 公司还提供有多个 AMV 合成试剂盒，不 同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有 oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ 引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括： 20mg 引物 20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下： 250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT; 20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各 5mmol/L)。 50ml 40mM 焦碳酸钠 625m rRNasin RNA 酶抑制剂 600m AMV 反转录酶 5mg 1.2kb 对照 RNA 200ml 10×第二链缓冲液，配方如下： 400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。 2m E.Coli RNaseH 500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ 100m T4 DNA PolymeraseⅠ 1.5ml 不含核酸酶的水 以上所有试剂除对照 RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成 40mgmRNA。 （一）第一链合成 下面介绍的是 25ml 体积反应系统，该系统可合成多至 2mgmRNA，每增加 1mg mRNA，需增 加反应体积 10ml，如 5mg mRNA 需 55ml 反应体积。 引物或引物-延接头和反转录酶与 mRNA 的比例应分别保持为 0.5mg/mg（对 NotⅠ引物-延接头 为 0.3mg/mg）和 15m/mg. 1、试剂：