如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸(dNTP)外，再加入一种少量的2'，3'dNTP,那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的 dNTP,结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A,每一个G,每一个C,每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列
如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的 ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列
在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种 DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5'3'外切核酸酶活 性)、其中一管中分别加入一种ddNTP（如ddTTP、dTTP) 以及其它三种dNTP(dATP、dCTP、dGTP),引物末端 用放射性核素标记，ddTTP的比例很小(1：10)，因此掺入 的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度 的DNA片段合成。它们都具有相同的5'末端，3'末端都因掺 入了ddTTP而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的 ddNTP
在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种 DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′ 3′外切核酸酶活 性）、其中一管中分别加入一种 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP） 以及其它三种dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP ），引物末端 用放射性核素标记， ddTTP的比例很小（1:10），因此掺入 的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度 的DNA片段合成。它们都具有相同的5′末端，3′末端都因掺 入了ddTTP而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的 ddNTP
引物 OH CTAAGCTCGACT 模板 dCTP,dGTP,dATP,dTTP Sanger 双脱氧测 +ddATP +ddCTP ddGTP ddTTP 序方法示 GATTCGAGCTGddA -gattcgagddc GATTCGAGCTddG GATTCGAGCddT ■-GATTCGddA -GATTddC GATTCGAddG GATddT GddA GATTCddG GAddT 意图 ddG 1 9876 40HOO 5432 4OO HH A 凝胶放射自显影图 互补链序列
Sanger 双脱氧测 序方法示 意图
5'.CACTGATGAGTCOGTGAACGAAACGG.-3 双脱氧法测序原理示意图 G T G MUHOCOH OHOOOOOHHOOHHHOOO =三
双脱氧法测序原理示意图
(二)DNA序列测定的策略 1、测序载体和引物 双脱氧链终止法测定DNA序列时，通常是将待测片段先克 隆到M13载体（如M13mp18和M13mp19)或质粒载体 (如pUC18和pUC19)。克隆于M13载体，可获得单链模 板。克隆于pUC载体，则是直接采用双链DNA作为测序模 板，待测DNA克隆到质粒载体后，通过碱变性处理重组载 体，使测序引物便于结合模板DNA
（二）DNA序列测定的策略 1、测序载体和引物 双脱氧链终止法测定DNA序列时，通常是将待测片段先克 隆到M13载体（如M13mp18和M13mp19）或质粒载体 （如pUC18和pUC19）。克隆于M13载体，可获得单链模 板。克隆于pUC载体，则是直接采用双链DNA作为测序模 板，待测DNA克隆到质粒载体后，通过碱变性处理重组载 体，使测序引物便于结合模板DNA