分子生物学实验指导 第一节、实验室规则及安全防扩 ·、实验室规则 二、实验室安全防护 第二节、分子生物学常用研究技术 一、核酸分离纯化 二、聚合酶链反应技术 三、分子杂交技术 四、分子克隆技术 五、其它新技术 第三节、常用仪器使用 一、离心机 二、分光光度计 三、PCR仪 第四节、如何撰写实验报告 第五节核酸分离纯化技术 实验 实验三、质粒DNA的提取制备与检测 第六节PCR技术 实验四、常规PCR技术 实验五、定量PCR技术 第七节分子克隆技术 实验六、DNA的限制性酶切与电泳 实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收 实验八、DN连接实验 实验九、感受态细胞的制备 实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选 第八节分子杂交技术 实验十 Southern印迹杂交 实验十二、 Northern 印迹杂交 实验十 Western印迹 实验十四、核酸原位杂交 第九节综合性实验
分子生物学实验指导 第一节、实验室规则及安全防护 一、实验室规则 二、实验室安全防护 第二节、分子生物学常用研究技术 一、核酸分离纯化 二、聚合酶链反应技术 三、分子杂交技术 四、分子克隆技术 五、其它新技术 第三节、常用仪器使用 一、离心机 二、分光光度计 三、PCR 仪 第四节、如何撰写实验报告 第五节 核酸分离纯化技术 实验一、基因组 DNA 的提取制备与检测 实验二、总 RNA 的提取制备与检测 实验三、质粒 DNA 的提取制备与检测 第六节 PCR 技术 实验四、常规 PCR 技术 实验五、定量 PCR 技术 第七节 分子克隆技术 实验六、DNA 的限制性酶切与电泳 实验七、凝胶中 DNA 片断的纯化回收 实验八、DNA 连接实验 实验九、感受态细胞的制备 实验十、重组 DNA 转化与篮白斑筛选 第八节 分子杂交技术 实验十一、Southern 印迹杂交 实验十二、Northern 印迹杂交 实验十三、Western 印迹 实验十四、核酸原位杂交 第九节 综合性实验
实验十五、蛋白质双向电泳 实验十六、酵母双杂交实验 实验十七 ,RNA干扰实验 第一节、实验室规则及安全防护 一、实验室规则 1.每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑 2.实验前认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的，基本原理，操作步骤，懂得每 步操作的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3.实验时要听从指导老师的指导，严格认真地按规程进行实验，并注意与同组同学的 配合。未经许可，不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等。 4.实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上。实验结束时，实验记录必须送 指导老师审阅后方可离开实验室：实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老 师。 5.保持台面、地面、水槽内及室内整洁。精心爱护各种仪器，要随时保持仪器的清洁。 如发生故障，应立即停止使用并报告指导老师。完成实验后应将器材洗净，把器材、药品归 放回原处，试管倒置于试管架中并排列整齐。按规定处理好废物，废液，做好清洁卫生。器 材、仪器如有损坏须立即报告指导老师并按学校规定进行适当比例赔偿， 6.按需要量取药品及蒸馏水等各种物品，注意节约。 7.公用仪器，药品用后放回原处。多取的药品不得重新倒入原试剂瓶内。公用试剂瓶 的瓶塞要随开随盖，不得混滑，更不能互相污染。严禁用口吸或用皮肤接触有毒药品与试剂 8.需交指导老师保存的样品，药品及其他物品都应加盖，并标注自己的姓名，班级， 日期及内容物。 9.废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。含强酸，碱及有毒废液应倒入废液缸。废纸 后及其它固体废物和带渣滓的废物倒入废品妾或废品缸中，不能倒入水槽或到处乱扔。书包 及实验不需之物品放在规定处。 10.实验室内严禁吸烟！不得将含易燃溶剂的溶液近火。对电炉等火源，严格做到：人 在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。 实验完毕，应立即拔去电炉插头和关好水龙头，拉下电闸。漏电的设备一律不得使用。离开
实验十五、蛋白质双向电泳 实验十六、酵母双杂交实验 实验十七、RNA 干扰实验 第一节、实验室规则及安全防护 一、实验室规则 1．每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2．实验前认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的，基本原理，操作步骤，懂得每一 步操作的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3．实验时要听从指导老师的指导，严格认真地按规程进行实验，并注意与同组同学的 配合。未经许可，不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等。 4．实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上。实验结束时，实验记录必须送 指导老师审阅后方可离开实验室；实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老 师。 5．保持台面、地面、水槽内及室内整洁。精心爱护各种仪器，要随时保持仪器的清洁。 如发生故障，应立即停止使用并报告指导老师。完成实验后应将器材洗净，把器材、药品归 放回原处，试管倒置于试管架中并排列整齐。按规定处理好废物，废液，做好清洁卫生。器 材、仪器如有损坏须立即报告指导老师并按学校规定进行适当比例赔偿。 6．按需要量取药品及蒸馏水等各种物品，注意节约。 7．公用仪器，药品用后放回原处。多取的药品不得重新倒入原试剂瓶内。公用试剂瓶 的瓶塞要随开随盖，不得混淆，更不能互相污染。严禁用口吸或用皮肤接触有毒药品与试剂。 8．需交指导老师保存的样品，药品及其他物品都应加盖，并标注自己的姓名，班级， 日期及内容物。 9．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。含强酸，碱及有毒废液应倒入废液缸。废纸 屑及其它固体废物和带渣滓的废物倒入废品篓或废品缸中，不能倒入水槽或到处乱扔。书包 及实验不需之物品放在规定处。 10．实验室内严禁吸烟！不得将含易燃溶剂的溶液近火。对电炉等火源，严格做到：人 在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。 实验完毕，应立即拔去电炉插头和关好水龙头，拉下电闸。漏电的设备一律不得使用。离开
实验室前应该检查水、电、窗等是否关好。 11.实验室内一切物品，未经教师批准，严禁带出室外。 12.每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫 生、安全和其它服务性工作。 二、实验室安全防护 实验室是学校教学的重要科学基地，贮存有贵重的仪器和化学危险药品等。为防止损失 和产生事故，必须做好防盗、防火、防水、防毒和安全用电等工作。 (一)防盗 1,加强防卫，经常检查，堵塞漏洞。 2.非工作人员不得进入仪器室，室内无人时随即关好门窗。 3.仪器室内不会客，不住宿，未经领导同意，谢绝参观。 4.发生盗窃案件时，保护好现场，及时向领导、治安部门报告。 (二)防火、防爆 1.严禁在仪器室内生火取暖。 2.易燃、易爆的化学药品要妥善分开保管，应按药品的性能，分别做好贮藏工作，注 意安全。 3.做化学实验时要严格按照操作规程进行，谨防失火、操炸等事故发生。 (三)防水 1.实验室的上、下水道必须保持通畅。 2.冬季做好水管的保暖和放空工作，要防止水管受冻爆裂酿成水患。 (四)防毒 1.实验室必须做好防毒工作，有毒物质应妥善保管和贮藏，实验后的有毒残液要妥善 处理。 2.凡易燃、易毒、腐蚀剂等危险性药品要设专柜单独存放。要定期检查，严格管理， 做到双人管理、双人收发、双人领取、双人记帐、双人把锁。 3.实验中严格遵守操作规程，制作有毒气体要在通风橱内进行，保持实验室内通风良 好。 4.化学实验室备有废液缸，实验室附近有废液处理池，防止有毒物质随意排放。 (五)安全用电 1,实验室电路及用电设施要定期检修，保证安全，决不“带病”工作
实验室前应该检查水、电、窗等是否关好。 11．实验室内一切物品，未经教师批准，严禁带出室外。 12．每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫 生、安全和其它服务性工作。 二、实验室安全防护 实验室是学校教学的重要科学基地，贮存有贵重的仪器和化学危险药品等。为防止损失 和产生事故，必须做好防盗、防火、防水、防毒和安全用电等工作。 （一）防盗 1．加强防卫，经常检查，堵塞漏洞。 2．非工作人员不得进入仪器室，室内无人时随即关好门窗。 3．仪器室内不会客，不住宿，未经领导同意，谢绝参观。 4．发生盗窃案件时，保护好现场，及时向领导、治安部门报告。 （二）防火、防爆 1．严禁在仪器室内生火取暖。 2．易燃、易爆的化学药品要妥善分开保管，应按药品的性能，分别做好贮藏工作，注 意安全。 3．做化学实验时要严格按照操作规程进行，谨防失火、爆炸等事故发生。 （三）防水 1．实验室的上、下水道必须保持通畅。 2．冬季做好水管的保暖和放空工作，要防止水管受冻爆裂酿成水患。 （四）防毒 1．实验室必须做好防毒工作，有毒物质应妥善保管和贮藏，实验后的有毒残液要妥善 处理。 2．凡易燃、易毒、腐蚀剂等危险性药品要设专柜单独存放。要定期检查，严格管理， 做到双人管理、双人收发、双人领取、双人记帐、双人把锁。 3．实验中严格遵守操作规程，制作有毒气体要在通风橱内进行，保持实验室内通风良 好。 4．化学实验室备有废液缸，实验室附近有废液处理池，防止有毒物质随意排放。 （五）安全用电 1．实验室电路及用电设施要定期检修，保证安全，决不“带病”工作
2.如有电器失火，应立即切断电源，用沙子或灭火器扑灭。在未切断电源前，切忌用 水或泡沫灭火机灭火。 3.遇有人身触电事故，应立即切断电源，及时进入人工呼吸，急送医院救治。 第二节、分子生物学常用研究技术 一、核酸分离纯化 核酸分子是分子生物学技术所涉及的主要对象，核酸分离纯化的质量好坏直接关系到后 续实验的成败，所以核酸的分离提取是分子生物学研究中的一项重要的基本技术。 核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生 物的DNA包括染色体DNA与细胞器DNA,前者位于核内，约占95%，分子量大，是双链 线性分子：后者位于线粒体或叶绿体，约占5%，分子量较小，为双链环状分子。原核生物 除了双链环状的染色体DNA外，还有双链环状的质粒DNA。在DNA病毒颗粒中，DNA 的分子构型多种多样，有双链环状、双链线状、单链环状、单链线状等形式。在RNA病毒 中，RNA的分子构型有双链线状和单链线状的差异。基因组DNA的总长度在不同的生物之 间差异很大，一般随生物的进化程度而增大。与DNA相比，RNA要小的多，它的种类、大 小和结构具有多样化，主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞 器中，RNA以rRNA的数量最多(80%~85%)，tRNA及核内小分子RNA占10%~15% 而mRNA分子大小不一，序列各异。DNA在碱性条件下相对稳定，而RNA在酸性条件下 相对稳定，但强酸、强碱均可导致两者的变性与降解。DNA与RNA理化性质及细胞定位上 的差异决定了两者的分离与纯化条件是不同的。 分子生物学实验中最经常进行的是基因组DNA、质粒DNA以及细胞总RNA的分离提 取。真核细胞基因组DNA分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒缠绕法 等：质粒DNA分离提取的方法有碱裂解法、煮沸裂解法及SDS裂解法等。总RNA的提取 方法主要是最常用的异硫氰酸胍倒/氯仿一步法。另外，近年来世界各大商业公司也纷纷投 入巨资开发新的更为简便的核酸分离纯化试剂盒，从而使核酸的分离纯化更为方便、快捷、 高效和自动化。 尽管核酸分离纯化的方法很多，但无论采取何种方法，其基本原则均为：①保证核酸 一级结构的完整性，因为完整的一级结构是进行核酸结构与功能研究的基本前提：②排除 其它分子的污染，保证核酸制品的纯度，以满足后续实验的要求。因此，核酸分离纯化的基
2．如有电器失火，应立即切断电源，用沙子或灭火器扑灭。在未切断电源前，切忌用 水或泡沫灭火机灭火。 3．遇有人身触电事故，应立即切断电源，及时进入人工呼吸，急送医院救治。 第二节、分子生物学常用研究技术 一、核酸分离纯化 核酸分子是分子生物学技术所涉及的主要对象，核酸分离纯化的质量好坏直接关系到后 续实验的成败，所以核酸的分离提取是分子生物学研究中的一项重要的基本技术。 核酸包括 DNA 和 RNA 两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生 物的 DNA 包括染色体 DNA 与细胞器 DNA，前者位于核内，约占 95％，分子量大，是双链 线性分子；后者位于线粒体或叶绿体，约占 5％，分子量较小，为双链环状分子。原核生物 除了双链环状的染色体 DNA 外，还有双链环状的质粒 DNA。在 DNA 病毒颗粒中，DNA 的分子构型多种多样，有双链环状、双链线状、单链环状、单链线状等形式。在 RNA 病毒 中，RNA 的分子构型有双链线状和单链线状的差异。基因组 DNA 的总长度在不同的生物之 间差异很大，一般随生物的进化程度而增大。与 DNA 相比，RNA 要小的多，它的种类、大 小和结构具有多样化，主要存在于细胞质中，约占 75%，另有 10%在细胞核内，15%在细胞 器中，RNA 以 rRNA 的数量最多（80％～85%），tRNA 及核内小分子 RNA 占 10%～15%， 而 mRNA 分子大小不一，序列各异。DNA 在碱性条件下相对稳定，而 RNA 在酸性条件下 相对稳定，但强酸、强碱均可导致两者的变性与降解。DNA 与 RNA 理化性质及细胞定位上 的差异决定了两者的分离与纯化条件是不同的。 分子生物学实验中最经常进行的是基因组 DNA、质粒 DNA 以及细胞总 RNA 的分离提 取。真核细胞基因组 DNA 分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒缠绕法 等；质粒 DNA 分离提取的方法有碱裂解法、煮沸裂解法及 SDS 裂解法等。总 RNA 的提取 方法主要是最常用的异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法。另外，近年来世界各大商业公司也纷纷投 入巨资开发新的更为简便的核酸分离纯化试剂盒，从而使核酸的分离纯化更为方便、快捷、 高效和自动化。 尽管核酸分离纯化的方法很多，但无论采取何种方法，其基本原则均为：① 保证核酸 一级结构的完整性，因为完整的一级结构是进行核酸结构与功能研究的基本前提；② 排除 其它分子的污染，保证核酸制品的纯度，以满足后续实验的要求。因此，核酸分离纯化的基
本步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其 它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质，纯化核酸等。不同的核酸分 离纯化方法分别具有不同的特点及适用范围，因此，在实际应用中，应根据具体生物材料、 待提取的核酸分子的特点和研究目的对核酸完整性、纯度、产量的要求而选择不同的方法。 二、聚合酶链反应技术 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术，是一种利用DNA变性和复性 原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，应用这一技术可以将特定的微量靶DNA 片断于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR技术的创立对于分子生物学的发展具有不可 估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分 子生物学研究中应用最为广泛的方法，极大的推动了分子生物学学科本身以及整个生物医学 的发展。PCR技术当之无愧是生物医学领域中的一项革命性技术创举和里程碑。PCR技术 由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K.Mullis等于二十世纪八十年代中期发明创立，K Mullis也因此贡献而获得了1993年度的诺贝尔化学奖。 PCR技术的基本原理类似于DNA的体内复制过程，即以拟扩增的DNA分子为模板、 以一对分别与模板S末端和3末端相互补的寡核苷酸片断为引物、以四种NTP为原料、由 DNA聚合酶按照半保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新的DNA,不断重复这一过程， 即可使目的DNA分子得到扩增。PCR反应体系的基本成分包括有：模板DNA、引物、四 种dNTP、耐热性DNA聚合酶以及含有mg2*的缓冲液。 PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸三个基本反应：①模板DNA的变性：模板 DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链变性解离成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备：②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，将反应体系的温度下降至适宜温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合：③ 引物的延伸：与DNA模板结合的引物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。上 述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮反应的模板，经多次循环(25 次~40次)，即可达到扩增DNA片断的目的。 近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR技术本身也不断发展，操作也更为精细和 自动化，如高保真PCR、热启动PCR、长距离PCR、巢式PCR和梯度PCR技术的出现。 同时，PCR技术也和已有其它分子生物学技术结合，进而形成多种PCR衍生技术。 常见的PCR衍生技术有：
本步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其 它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质，纯化核酸等。不同的核酸分 离纯化方法分别具有不同的特点及适用范围，因此，在实际应用中，应根据具体生物材料、 待提取的核酸分子的特点和研究目的对核酸完整性、纯度、产量的要求而选择不同的方法。 二、聚合酶链反应技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，是一种利用 DNA 变性和复性 原理在体外进行特定的 DNA 片断高效扩增的技术，应用这一技术可以将特定的微量靶 DNA 片断于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR 技术的创立对于分子生物学的发展具有不可 估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分 子生物学研究中应用最为广泛的方法，极大的推动了分子生物学学科本身以及整个生物医学 的发展。PCR 技术当之无愧是生物医学领域中的一项革命性技术创举和里程碑。PCR 技术 由美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 K. Mullis 等于二十世纪八十年代中期发明创立，K. Mullis 也因此贡献而获得了 1993 年度的诺贝尔化学奖。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的体内复制过程，即以拟扩增的 DNA 分子为模板、 以一对分别与模板 5'末端和 3'末端相互补的寡核苷酸片断为引物、以四种 dNTP 为原料、由 DNA 聚合酶按照半保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新的 DNA，不断重复这一过程， 即可使目的 DNA 分子得到扩增。PCR 反应体系的基本成分包括有：模板 DNA、引物、四 种 dNTP、耐热性 DNA 聚合酶以及含有 mg2+的缓冲液。 PCR 的基本反应步骤包括变性、退火和延伸三个基本反应：①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 95℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链变性解离成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单 链后，将反应体系的温度下降至适宜温度，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：与 DNA 模板结合的引物在 DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的新链。上 述三个步骤称为一个循环，新合成的 DNA 分子继续作为下一轮反应的模板，经多次循环（25 次～40 次），即可达到扩增 DNA 片断的目的。 近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR 技术本身也不断发展，操作也更为精细和 自动化，如高保真 PCR、热启动 PCR、长距离 PCR、巢式 PCR 和梯度 PCR 技术的出现。 同时，PCR 技术也和已有其它分子生物学技术结合，进而形成多种 PCR 衍生技术。 常见的 PCR 衍生技术有：