第六章基因文库构建与筛选 第一节工具酶、克隆载体 一、工只酶 分子克隆工具酶是一类用于DN重组过程中不同DNM分子的制备、切割、修饰、扩增，核酸分子 的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体，有 少数酶则是来自动物和动物病毒 限制性内切酶 限制性内切酶是一类主要分离于原核生物，能够识别双链DNA(s-DNA)分子 中特定核苷酸序列并将其切断的酶，常常简称为限制酶(restriction enzymes)。 T4DNA连接酶 T4DN州连接酶(T4 DNA Lige阳se)是分子克隆实验中最常用的工具酶之一，该酶催 化双链DNA分子中相邻的3'一羟基和5'-磷酸基间磺酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有钻性末 端的DM片段，也可以连接两个具有平端的DA片段，但是连接后者所需的酶量往往是连接前者的 50倍 DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA或RNA作为模板合成新的DNA链，这些新合成 的链或是用于DNA标记，或是用于DNA序列分析，或是用于DNA重组，或是用于某些感兴趣的DNA 片段的扩增。因此，不同的DNA聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。DNA聚合酶I,反转录 酶Tg,DNA聚合垂 磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶 磷酶酶的作用说是将D末端中的5' -端磷酸基除去，使其5' 端变成了0咀基。该酶有2个主要的用途： 一是将载体末端的磷酸荃除掉，避免在DNA重组时载体分 子的自我连接：另一用途就是和下述的T4多聚核苷酸激酶连用，用于DA的末端标记。 T4核苷酸激酶广泛用于DNA和NA的5'-末端标记，标记时以[r-P]ATP作为底物。采用转 移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必须除去5'-端未标记磷酸基 末聪氧核苷酸转移酶 末端转移酶主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末端加上一个 同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补（即A和T,C和G)的尾巴后 经过退火或 复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶I 一种非特异性的DNA内切酶，它能降解双链DNA为5'-磷酸低聚核苷酸。 Nasel的酶活性需要一价阳离子作为辅助因子。其中，Ca”和M或Ca“和“使该酶达到最大活性 核酸酶 在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用RA分子，最常用的R醇有以下两 RNaseA 作用于NA的专一性内切醇，它特异性地作用于嘧啶核苷酸，该蘭主要用于除去DNA 制备物中的RNA。 RNase H 该酶不象其它NA酶那样会降解游离的RN分子，它只能专一性地分解DNA/RN 杂交分子中的RNA分子。该酶主要用于cDNM合成过程中除去cDNA-RNA中的RNM链。 在分子克隆过程中，除了使用一些可直接作用于DNA的醇类外 还常常要使用一些其他 酶以便D,RA的提取和纯化，或是用于基因的筛选，下面仅列举几种常用酶的主要特性和用途。 细胞壁裂解酶 该酶主要用于消化细菌的细胞壁，以便于染色体和质粒DNM的提取。又如用于植 物细胞壁裂解的纤维素酶、半纤维素酶和几丁酶等。 蛋白酶K 该酶是一种具高活性的蛋白水解酶，它能使许多微生物和哺乳动物细胞中 的核酸酶失活。此酶在很宽的p州范围内（最适pH7.5-12)均具活性，对热稳定，在高浓 度的SDS,DTA和尿素环境中仍具酶活性， 所以它对于RNA和高分子量DNA的提取纯化 非常有用。 二、克隆载体的基本结构和功能 所有的分子克隆载体都具备以下3个最基本的结构：
1 第六章 基因文库构建与筛选 第一节 工具酶、克隆载体 一、工具酶 分子克隆工具酶是一类用于 DNA 重组过程中不同 DNA 分子的制备、切割、修饰、扩增, 核酸分子 的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体, 有 少数酶则是来自动物和动物病毒。 限制性内切酶 限制性内切酶是一类主要分离于原核生物, 能够识别双链 DNA(ds-DNA)分子 中特定核苷酸序列并将其切断的酶, 常常简称为限制酶(restriction enzymes)。 T4 DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶(T4 DNA Ligase)是分子克隆实验中最常用的工具酶之一，该酶催 化双链 DNA 分子中相邻的 3'-羟基和 5'-磷酸基间磷酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末 端的 DNA 片段，也可以连接两个具有平端的 DNA 片段，但是连接后者所需的酶量往往是连接前者的 50 倍。 DNA 聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以 DNA 或 RNA 作为模板合成新的 DNA 链，这些新合成 的链或是用于 DNA 标记，或是用于 DNA 序列分析，或是用于 DNA 重组，或是用于某些感兴趣的 DNA 片段的扩增。 因此，不同的 DNA 聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。DNA 聚合酶 I，反转录 酶 Taq ，DNA 聚合酶 磷酸酶和 T4 多聚核苷酸激酶 磷酶酶的作用说是将 DNA 末端中的 5’-端磷酸基除去，使其 5’- 端变成了 OH 基。该酶有 2 个主要的用途：一是将载体末端的磷酸荃除掉，避免在 DNA 重组时载体分 子的自我连接；另一用途就是和下述的 T4 多聚核苷酸激酶连用，用于 DNA 的末端标记。 T4 核苷酸激酶广泛用于 DNA 和 RNA 的 5'-末端标记，标记时以[r- 32P]ATP 作为底物。采用转 移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必须除去 5'-端未标记磷酸基。 末端脱氧核苷酸转移酶 末端转移酶主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末端加上一个 同聚物尾巴，两种不同的 DNA 分子加上不同的但可以互补(即 A 和 T，C 和 G)的尾巴后， 经过退火或 复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起。这种加尾方法在 cDNA 文库建立时是使 cDNA 插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶 I 一种非特异性的 DNA 内切酶，它能降解双链 DNA 为 5'-磷酸低聚核苷酸。 DNaseI 的酶活性需要二价阳离子作为辅助因子。其中， Ca++和 Mg++或 Ca++和 Mn++使该酶达到最大活性。 核酸酶 在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用 RNA 分子，最常用的 RNA 酶有以下两种： RNaseA 作用于 RNA 的专一性内切酶，它特异性地作用于嘧啶核苷酸，该酶主要用于除去 DNA 制备物中的 RNA。 RNase H 该酶不象其它 RNA 酶那样会降解游离的 RNA 分子，它只能专一性地分解 DNA/RNA 杂交分子中的 RNA 分子。该酶主要用于 cDNA 合成过程中除去 cDNA-RNA 中的 RNA 链。 在分子克隆过程中，除了使用一些可直接作用于 DNA 的酶类外， 还常常要使用一些其他 酶以便 DNA，RNA 的提取和纯化，或是用于基因的筛选，下面仅列举几种常用酶的主要特性和用途。 细胞壁裂解酶 该酶主要用于消化细菌的细胞壁，以便于染色体和质粒 DNA 的提取。又如用于植 物细胞壁裂解的纤维素酶、半纤维素酶和几丁酶等。 蛋白酶 K 该酶是一种具高活性的蛋白水解酶，它能使许多微生物和哺乳动物细胞中 的核酸酶失活。此酶在很宽的 pH 范围内(最适 pH7.5-12)均具活性，对热稳定，在高浓 度的 SDS，EDTA 和尿素环境中仍具酶活性，所以它对于 RNA 和高分子量 DNA 的提取纯化 非常有用。 二、克隆载体的基本结构和功能 所有的分子克隆载体都具备以下 3 个最基本的结构：
1)至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制： 2)至少应右一个克隆位占.以供外源DNA插入 3)至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DA分子是否讲入宿主细韵」 由于DNA的复制是始于复制起点的 一个N分子有了复制起点， 那么这个DN分子就可以自主 制。如果 分子斑座我华省了复州些么莲我体欧以在美种生物的阳胞中自主复，因这 我体就可以多拷贝地存在于某种细胞内。 如果一个载体有两个或两个以上的复制起点，有两种情况：一是两个复制起点话用的宿主细胞不一样， 比如说，一个复制起点适合于大肠杆菌，因为大肠杆菌是基因工程中使用频率最高的宿主菌，另一个复制 起点适合于另一种细菌或真核生物细胞 那么这种克隆载体常称之为穿梭载体(shuttl ),换言 之，穿梭载体 可在两种 内进行来回的 况是同 的两个复制起点都是适合】 种细胞的，只不过这两个复制起点分别是在一定遗传背景条件下起作用，这种类型的载体多数是属于大肠 杆茵的载体 克降载体的克隆位点 分子克隆载体的目的就是要将外源基因通过体外重组，形成重组M分子，然后再转移到某种宿主细胞内， 那么克隆载体就应该有一个位点供外源DA插入，这个位点就是克隆位点。克隆位点一定是 个限制酶切 位点，而且必须是由6个核苷酸或6个核苷酸以上的序列组成的限制酶识别位点。 克隆载体的标记基因 既指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又指示载体DN分子中是否插入了外源DNA片段。 克降载体的种类 按照古隆载体的功能或用途来别分，到可将DNA搬体分为以下两大米 )普通型载体：这类载体主要用于各种基因组文库和cDA文库的建立 比如常用的BR322,由 入衍生的载体和COs质粒，以及一些大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体，如YRp7,YEDl3等。 2)表达型基因(expression vector):这类载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产 些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于CDA文库的建立。 第二节基因文库的构建 一、基因文库 基因文库：利用重组体DNA技术将某种生物细胞的基因组D的所有片段随机连接到基因载体上，转入 合适的宿主细胞中，通过细胞增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组的全部基因 都包含在内的情况下，这一组克隆的总体称为该生物的基因文库(gene1ibr y)。基因文库与甚因库在 意义上完全 同 基因库是指梨 物群体中基因的总称 NA重组实验的目的通常是为了分 物的特定基因。这些特定基因的产物在医学上、生物技术上或者了解细胞功能上具有非常重要的作用。为 了克隆这样的基因，必须从大量的基因中找出目的基因。为了减小工作量，提高选择效率，一般多采用构 建基因文库的方法。 一、构建其因文库的略 大肠杆菌载体对插入外源DNA片段的容量很有限（小于IOKb 入噬菌体载体约为20Kb,粘粒载体 约为40Kb。酵母人工染色体(YAC)载体以酵母为宿主菌，可插入外源基因片段的长度范围在0.3~12Mb 之何。 从基因组DNA或CDNA构建一个有实用价值的面组DNA文库，主要问题是在所构建的文库中必须 有足够多的克隆数，才能确保基因组DNA或c NA序列中的 一个序列至心右一个 存在于重组DNA 文库中。基因组DNA 和DNA文库的构建，基本的方法是相 似的 首先，制备基因组D 或cDNA升 选择适当的载体，用连接酶将载体与制备的DNA或cDNA片段连接起来，通过体外包装进入入噬菌体的 头部或通过直接转化而导入大肠杆菌，构建成基因组DNA或cDNA文库。 对于构建一个文库，有两大基本要点：首先，保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染 如果外源DA序列可与分离目的克隆的探针发生假阳性结合，显然将会对文库的筛选带来灾难性的后果
2 1） 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制； 2） 至少应有一个克隆位点，以供外源 DNA 插入； 3） 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组 DNA 分子是 否进入宿主细胞。 由于 DNA 的复制是始于复制起点的，因此只要一个 DNA 分子有了复制起点，那么这个 DNA 分子就可以自主 复制。如果一个分子克隆载体有了复制起点，那么该载体就可以在某种生物的细胞中自主复制，因此这个 载体就可以多拷贝地存在于某种细胞内。 如果一个载体有两个或两个以上的复制起点，有两种情况：一是两个复制起点适用的宿主细胞不一样， 比如说，一个复制起点适合于大肠杆菌，因为大肠杆菌是基因工程中使用频率最高的宿主菌，另一个复制 起点适合于另一种细菌或真核生物细胞，那么这种克隆载体常称之为穿梭载体（shuttle vector），换言 之，穿梭载体可在两种生物内进行来回的穿梭；另一种情况是同一个载体中的两个复制起点都是适合于一 种细胞的，只不过这两个复制起点分别是在一定遗传背景条件下起作用，这种类型的载体多数是属于大肠 杆菌的载体。 克隆载体的克隆位点 分子克隆载体的目的就是要将外源基因通过体外重组，形成重组 DNA 分子，然后再转移到某种宿主细胞内， 那么克隆载体就应该有一个位点供外源 DNA 插入，这个位点就是克隆位点。克隆位点一定是一个限制酶切 位点，而且必须是由 6 个核苷酸或 6 个核苷酸以上的序列组成的限制酶识别位点。 克隆载体的标记基因 既指示外源 DNA 是否进入了宿主细胞，又指示载体 DNA 分子中是否插入了外源 DNA 片段。 克隆载体的种类 按照克隆载体的功能或用途来划分，则可将 DNA 载体分为以下两大类： 1) 普通型载体：这类载体主要用于各种基因组文库和 cDNA 文库的建立， 比如常用的 pBR322，由 λ 衍生的载体和 COs 质粒，以及一些大肠杆菌- 酿酒酵母穿梭载体， 如 YRp7，YEp13 等。 2) 表达型基因(expression vector)：这类载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一 些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于 cDNA 文库的建立。 第二节 基因文库的构建 一、基因文库 基因文库:利用重组体 DNA 技术将某种生物细胞的基因组 DNA 的所有片段随机连接到基因载体上，转入 合适的宿主细胞中，通过细胞增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组的全部基因 都包含在内的情况下，这一组克隆的总体称为该生物的基因文库（gene library）。基因文库与基因库在 意义上完全不同，基因库是指某一生物群体中基因的总称。 DNA 重组实验的目的通常是为了分离一个生 物的特定基因。这些特定基因的产物在医学上、生物技术上或者了解细胞功能上具有非常重要的作用。为 了克隆这样的基因，必须从大量的基因中找出目的基因。为了减小工作量，提高选择效率，一般多采用构 建基因文库的方法。 二、构建基因文库的策略 大肠杆菌载体对插入外源 DNA 片段的容量很有限（小于 10Kb）， λ噬菌体载体约为 20Kb，粘粒载体 约为 40Kb。酵母人工染色体（YAC）载体以酵母为宿主菌，可插入外源基因片段的长度范围在 0.3～1.2Mb 之间。 从基因组 DNA 或 cDNA 构建一个有实用价值的重组 DNA 文库，主要问题是在所构建的文库中必须 有足够多的克隆数，才能确保基因组 DNA 或 cDNA 序列中的每一个序列至少有一个拷贝存在于重组 DNA 文库中。基因组 DNA 和 cDNA 文库的构建，基本的方法是相似的。首先，制备基因组 DNA 或 cDNA 并 选择适当的载体，用连接酶将载体与制备的 DNA 或 cDNA 片段连接起来，通过体外包装进入λ噬菌体的 头部或通过直接转化而导入大肠杆菌，构建成基因组 DNA 或 cDNA 文库。 对于构建一个文库，有两大基本要点：首先，保证载体 DNA 和靶 DNA 均不被外源 DNA 序列污染。 如果外源 DNA 序列可与分离目的克隆的探针发生假阳性结合，显然将会对文库的筛选带来灾难性的后果
因此，实验操作时一定要细心、要绝对干净，在可能的情况下，整个实验过程中尽量使用一次性材料。其 次，构建一个文库最简单的途径就是“电话克隆”，即通过电话等通讯方式从拥有你所需要的文库的研究者 那里索取。一是因为许多有价值的文库包括人类、哺乳动物基因组或cDNA文库已经成功地构建多年了。 二是因为大多数文库的拥有者十分愿意将他们构建的文库提供给其他的研究者。而许多期刊也要求作者对 已发表的文章中使用的文库或单个克隆免费提供给其他研究者。 另外， 对于 构建和保存的许多YAC 库，还可以从一些较大的院校及研究所的实验室获得：也可以从专门构建和销售文库的公司直接购买文库 或定购特殊的文库。构建重组DNA文库是一项非常费时和费力的工作，因此，只要有可能，无论是基因 组DNA文库还是cDNA文库，最好从其他实验室索取或从专门从事文库构建与销售的公司购买或定做。 否则，应使用构建文库的试剂盒。这些试剂盒可以为我们节省大量的金钱和时间。 三、构建基因文库的步骤 在原核生物中，结构基因通常会在基因组DA上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子 往往会被内含子分开。因此，对于原核基因和真核基因的分离，要采取不同的克隆步骤。 要克隆原核生 物中的基因，首先要用限制性内切酶对总DNA酶解，然后把这些德解的DNA片段克隆进载体，再对带右 外源D小A片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。 构建基因文库大多采用一种识别4个碱基序列的限制性内切酶进行酶解，理论上应该是每256(44)个碱 基就可切一次，调整酶解反应的条件可以使它部分酶解基因组DA,产生出所有的可能大小的片段。由 于限制性内切酶的位点在基因组上并不是随机排列的，有些片段可能会太大而无法克隆，这时文库就不完 整，要找到某一个特异的目的DNA片段也许就要难一些。 第三节基因文库的筛选 般而言，从任何组织分离的DNA均可以构建基因组文库。构建了文库以后，就需要鉴定出文库中 带有目的序列的克隆。这些目的基因之所以可以分离是因为：①它可以与特异性核酸探针杂交：②它表达 了一种可被己知抗体识别的蛋白质产物：③它可以被特异性引物扩增。当然，最简单的是目的基因在细菌 中能提供一种可供选择的表型（如颜色、形态），依据这种特殊的表型进行选择。通用的鉴定方法有三种： 是用标记的DNA探针作DNA杂交：二是用抗体对蛋白产物进行免疫杂交：三是对蛋白的活性进行鉴定 DNA杂交筛选 DNA杂交成功与否取决于探针和目的序列之间的碱基对能否形成稳定的碱基配对。用来筛选基因文 库的探针至少可以有两种来源，一是从近缘生物体中克隆的DNA用作异源探针，这种情况的杂交条件应 该调整到要允许一定程度的探针与目标DNA之间的错配，以补偿这两种的序列之间自然存在的差异： 是根据从 一个目的基因编码的蛋白的已知氨基酸序列推导出可能的核苷酸序列， 通过化学合成的方法来合 成一个探针。由于大多数基因文库都是通过部分醇解的方式构建的，因此杂交一般都会得到多个阳性克隆 要鉴定哪一个克隆包含了目的基因的完整序列，就要通过凝胶电泳和限制性内切酶酶谱先初步分析出每 个插入片段的长度，同时也鉴定出完全相同的克隆以及有重叠序列的克隆。通过序列的重叠，就可能得到 一个完整的基因，如果一个克隆中的插入片段大到可以包含一个完整的基因，那么就可以币过DNA测序 来认定， 看它是否有起始密码子和终山 密码子。如果一个 文库里得不到某个基因的完整序列，这就需要用 另 个不同的限制性内切酶去构建另一个文库，再用原先的探针进行筛选。或者构建一种插入片段比原米 核基因的平均长度大的基因文库，以增加获得完整目的基因的可能性。 二、免疫反应筛选 如果一个目的DNA序列可以转录和翻译 那么只要出现这种蛋白，甚至只需要蛋白的一部分，就可 以用免疫的方法来检测。从技术上讲，这个过程与D八A杂产过程有许多共同之处。通过免疫反应，就司 以根据发生颜色变化的克隆所在的位置，找出原始的培养板上与之相对应的克隆，这个克隆就可能包含 个完整的基因，也可能包含基因的一部分，但即使是基因的一部分，它也能产生足以让一抗识别的蛋白结 构区域。因此，还需要进一步鉴定阳性克隆中包含的基因是否完整
3 因此，实验操作时一定要细心、要绝对干净，在可能的情况下，整个实验过程中尽量使用一次性材料。其 次，构建一个文库最简单的途径就是“电话克隆”，即通过电话等通讯方式从拥有你所需要的文库的研究者 那里索取。一是因为许多有价值的文库包括人类、哺乳动物基因组或 cDNA 文库已经成功地构建多年了。 二是因为大多数文库的拥有者十分愿意将他们构建的文库提供给其他的研究者。而许多期刊也要求作者对 已发表的文章中使用的文库或单个克隆免费提供给其他研究者。另外，对于已构建和保存的许多 YAC 文 库，还可以从一些较大的院校及研究所的实验室获得；也可以从专门构建和销售文库的公司直接购买文库 或定购特殊的文库。构建重组 DNA 文库是一项非常费时和费力的工作，因此，只要有可能，无论是基因 组 DNA 文库还是 cDNA 文库，最好从其他实验室索取或从专门从事文库构建与销售的公司购买或定做。 否则，应使用构建文库的试剂盒。这些试剂盒可以为我们节省大量的金钱和时间。 三、构建基因文库的步骤 在原核生物中，结构基因通常会在基因组 DNA 上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子 往往会被内含子分开。因此，对于原核基因和真核基因的分离，要采取不同的克隆步骤。 要克隆原核生 物中的基因，首先要用限制性内切酶对总 DNA 酶解，然后把这些酶解的 DNA 片段克隆进载体，再对带有 外源 DNA 片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。 构建基因文库大多采用一种识别 4 个碱基序列的限制性内切酶进行酶解，理论上应该是每 256（44）个碱 基就可切一次，调整酶解反应的条件可以使它部分酶解基因组 DNA，产生出所有的可能大小的片段。由 于限制性内切酶的位点在基因组上并不是随机排列的，有些片段可能会太大而无法克隆，这时文库就不完 整，要找到某一个特异的目的 DNA 片段也许就要难一些。 第三节 基因文库的筛选 一般而言，从任何组织分离的 DNA 均可以构建基因组文库。构建了文库以后，就需要鉴定出文库中 带有目的序列的克隆。这些目的基因之所以可以分离是因为：①它可以与特异性核酸探针杂交；②它表达 了一种可被已知抗体识别的蛋白质产物；③它可以被特异性引物扩增。当然，最简单的是目的基因在细菌 中能提供一种可供选择的表型（如颜色、形态），依据这种特殊的表型进行选择。通用的鉴定方法有三种： 一是用标记的 DNA 探针作 DNA 杂交；二是用抗体对蛋白产物进行免疫杂交；三是对蛋白的活性进行鉴定。 一、DNA 杂交筛选 DNA 杂交成功与否取决于探针和目的序列之间的碱基对能否形成稳定的碱基配对。用来筛选基因文 库的探针至少可以有两种来源，一是从近缘生物体中克隆的 DNA 用作异源探针，这种情况的杂交条件应 该调整到要允许一定程度的探针与目标 DNA 之间的错配，以补偿这两种的序列之间自然存在的差异；二 是根据从一个目的基因编码的蛋白的已知氨基酸序列推导出可能的核苷酸序列，通过化学合成的方法来合 成一个探针。由于大多数基因文库都是通过部分酶解的方式构建的，因此杂交一般都会得到多个阳性克隆。 要鉴定哪一个克隆包含了目的基因的完整序列，就要通过凝胶电泳和限制性内切酶酶谱先初步分析出每一 个插入片段的长度，同时也鉴定出完全相同的克隆以及有重叠序列的克隆。通过序列的重叠，就可能得到 一个完整的基因，如果一个克隆中的插入片段大到可以包含一个完整的基因，那么就可以通过 DNA 测序 来认定，看它是否有起始密码子和终止密码子。如果一个文库里得不到某个基因的完整序列，这就需要用 另一个不同的限制性内切酶去构建另一个文库，再用原先的探针进行筛选。或者构建一种插入片段比原来 核基因的平均长度大的基因文库，以增加获得完整目的基因的可能性。 二、免疫反应筛选 如果一个目的 DNA 序列可以转录和翻译，那么只要出现这种蛋白，甚至只需要蛋白的一部分，就可 以用免疫的方法来检测。从技术上讲，这个过程与 DNA 杂产过程有许多共同之处。通过免疫反应，就可 以根据发生颜色变化的克隆所在的位置，找出原始的培养板上与之相对应的克隆，这个克隆就可能包含一 个完整的基因，也可能包含基因的一部分，但即使是基因的一部分，它也能产生足以让一抗识别的蛋白结 构区域。因此，还需要进一步鉴定阳性克隆中包含的基因是否完整
三、过酶活性筛选 如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，并且该摩对突变细胞的生长极为重 要，那么就可以通讨拾查酶活性存在与否来筛洗目的基因 亚克降：是指从DNA大片段中点路出带衔 基因的DNA小片段。利用它可以定位基因，除去多余的DNA序列 尽可能高倍的纯化 DNA是构建亚 隆的关键。具体做法是：使用限制性内切酶，从大片段得到小片段，连入载体，用前面的方法检出靶基因 片段。 四、应用： DNA序列分析、构建特定蛋白的表达载体 第四节cDNA文库的构建与筛选 一、DNA文库 ©DNA是包含某种生物可表达的遗传信总，不含有内含子的基因文库。可由某种特定组织细胞提取高 纯府的mRNA.经前转录产生的cDNA来构建。是克隆、分离目的基因的重题途径之一，cDNA片段经标 记可作为杂交探针，用于研究不同组织细胞和不同发有阶段的基因表达情况，并可通过与基因组文库的比 较分析来探索基因的结构、表达及调控。构建cDNA文库多用质粒载体，cDNA文库的完整程度由重组 粒转化的细菌菌落数来计算。构建一个cDNA文库最基本的步是从mRNA逆转录获得双链DNA拷贝的 过程。从mRNA到cDNA,一般来说，获得3一4Kb的全长cDNA拷贝应该是比较容易的，甚至对更大的 nRNA也是可行的。影向cDNA质量的最重要的因素是mRNA的质量，尤其针对较大的mRNA 在选择克隆策略和载体时应该首先考虑克隆的用途。在大多数情况下，如果采用常规的文库筛选方法 进行筛选 那么入载体 cDNA克隆 :如果用核酸探针杂交的方法筛选文库，那么任何插 入型的载体都是适用的：如果文库拟采用抗体探针进行筛选，那么就要选择适当的大肠杆菌表达载体。 二、cDNA文库的构建 L.mRNA的制备 由于真核生物细胞中蛋白质的种类不同，每一种蛋白质的量也不同，所以细胞中的mRNA的种类和数 千差万别。如果某种mRNA的量是丰富的，那么制备它是非常容易的。例如，在鸡的输卵管中，有一种 mRNA是非常丰富的，编码卵清蛋白，每个细胞中大约有IO万个分子，在很少的cDNA克隆中就可选择 到目的克隆：如果mRNA的量是贫乏的，那么必须首先富集mRNA,方法是用琼脂糖凝胶电泳分离、RT 一PCR扩增、oligo dT亲和层析柱分离等步骤构事cDNA文库，大约10的个克隆可以检出目的基因。 在所有RNA实验中，最关健的因素是分离得到全长的RNA。 而实验失败的主要原因是核糖核酸酶 (RNA醇)的污染， RNA酶很稳定， ·般而言反应不需辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RN 酶就会引起严重的后果。为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿等都需要特别处理。 整个RNA制备的操作过程必须戴手套。实验用溶液均需用焦碳酸二乙酯(DEPC,有致癌之嫌，须小心操 作)处理以使RNA酶失活：玻璃器皿须在30C干烤4h(高压不能完全灭活RNA酶)：塑料制品直接从 商品包装中取用，最好用氯仿冲洗处理。 大多数的信使RNA都带有pol(A尾， 而结构RNA没有。据此可将mRNA从rRNA和tRNA中分离 出 2、cDNA基因文库的构建 以mRNA为模板，通过逆转录酯的作用，获得大量的CDNA。再用获得的CDNA通过平末瑞连接或设 是加入衔接物等方法克隆进质粒载体或其他载体， 形成cDNA文库】 3、在cDNA克隆中随机引物的应用 始于mRNA的poly(A)尾巴合成cDNA时有三种局限：①并非所有的RNA3'端都带有poly(A)序列： ②对于大的mRNA难于预料cDNA的全合成：③由于cDNA合成始于poly(A)mRNA3'端，所以，3端 的序列被富集。前两种局限性在RNA病毒基因克隆中是共同的，第三种局限性对以入gI1或入ZAP为载 体构建cDNA文库和筛选融合多肽的克隆可能是重要的
4 三、过酶活性筛选 如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，并且该酶对突变细胞的生长极为重 要，那么就可以通过检查酶活性存在与否来筛选目的基因。 亚克隆：是指从 DNA 大片段中克隆出带靶 基因的 DNA 小片段。利用它可以定位基因，除去多余的 DNA 序列。尽可能高倍的纯化靶 DNA 是构建亚克 隆的关键。具体做法是：使用限制性内切酶，从大片段得到小片段，连入载体，用前面的方法检出靶基因 片段。 四、应用： DNA 序列分析、构建特定蛋白的表达载体 第四节 cDNA 文库的构建与筛选 一、DNA 文库 cDNA 是包含某种生物可表达的遗传信息，不含有内含子的基因文库。可由某种特定组织细胞提取高 纯度的 mRNA，经逆转录产生的 cDNA 来构建。是克隆、分离目的基因的重要途径之一，cDNA 片段经标 记可作为杂交探针，用于研究不同组织细胞和不同发育阶段的基因表达情况，并可通过与基因组文库的比 较分析来探索基因的结构、表达及调控。构建 cDNA 文库多用质粒载体，cDNA 文库的完整程度由重组质 粒转化的细菌菌落数来计算。构建一个 cDNA 文库最基本的步骤是从 mRNA 逆转录获得双链 DNA 拷贝的 过程。从 mRNA 到 cDNA，一般来说，获得 3—4Kb 的全长 cDNA 拷贝应该是比较容易的，甚至对更大的 mRNA 也是可行的。影响 cDNA 质量的最重要的因素是 mRNA 的质量，尤其针对较大的 mRNA。 在选择克隆策略和载体时应该首先考虑克隆的用途。在大多数情况下，如果采用常规的文库筛选方法 进行筛选，那么λ载体（λgt11）适用于 cDNA 克隆；如果用核酸探针杂交的方法筛选文库，那么任何插 入型的载体都是适用的；如果文库拟采用抗体探针进行筛选，那么就要选择适当的大肠杆菌表达载体。 二、cDNA 文库的构建 1．mRNA 的制备 由于真核生物细胞中蛋白质的种类不同，每一种蛋白质的量也不同，所以细胞中的 mRNA 的种类和数量 千差万别。如果某种 mRNA 的量是丰富的，那么制备它是非常容易的。例如，在鸡的输卵管中，有一种 mRNA 是非常丰富的，编码卵清蛋白，每个细胞中大约有 10 万个分子，在很少的 cDNA 克隆中就可选择 到目的克隆；如果 mRNA 的量是贫乏的，那么必须首先富集 mRNA，方法是用琼脂糖凝胶电泳分离、RT —PCR 扩增、oligo dT 亲和层析柱分离等步骤构建 cDNA 文库，大约 105 个克隆可以检出目的基因。 在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶 （RNA 酶）的污染，RNA 酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子，因而 RNA 制剂中只要存在少量的 RNA 酶就会引起严重的后果。为避免 RNA 酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿等都需要特别处理。 整个 RNA 制备的操作过程必须戴手套。实验用溶液均需用焦碳酸二乙酯（DEPC，有致癌之嫌，须小心操 作）处理以使 RNA 酶失活；玻璃器皿须在 3000C 干烤 4h（高压不能完全灭活 RNA 酶）；塑料制品直接从 商品包装中取用，最好用氯仿冲洗处理。 大多数的信使 RNA 都带有 poly(A)尾，而结构 RNA 没有。据此可将 mRNA 从 rRNA 和 tRNA 中分离 出来。 2、cDNA 基因文库的构建 以 mRNA 为模板，通过逆转录酶的作用，获得大量的 cDNA。再用获得的 cDNA 通过平末端连接或 是加入衔接物等方法克隆进质粒载体或其他载体，形成 cDNA 文库。 3、在 cDNA 克隆中随机引物的应用 始于 mRNA 的 poly(A)尾巴合成 cDNA 时有三种局限：①并非所有的 RNA 3' 端都带有 poly(A)序列； ②对于大的 mRNA 难于预料 cDNA 的全合成；③由于 cDNA 合成始于 poly(A) mRNA 3'端，所以， 3' 端 的序列被富集。前两种局限性在 RNA 病毒基因克隆中是共同的，第三种局限性对以λgt11 或λZAP 为载 体构建 cDNA 文库和筛选融合多肽的克隆可能是重要的
克服这些局限性的方法是使用随机引物，这类引物是化学合成的6核苷酸的混合物，它们沿RNA链随 机退火，促进全长cDNA的合成。 三、cDNA文库的筛选 最佳的cDNA文库应构建自目的mRNA高水平转录的组织或细胞。在高度分化的细胞中，某种特殊的 mRNA分子可能占总poly(A)mRNA的1/20，而有些mRNA则根本不存在或者在100,000个poly(A)mRNA 分子中仅有I个，丰度极低。因此，当选择一个cDNA文库时，必须努力获得从待筛选的mRNA丰度较 高的细胞构建的cDNA文库。相应地，有待筛选的克隆数目要由细胞中mRNA的丰度来决定。细胞中某 种蛋白质的表达量常常是表明mRNA丰度的敏感指标。据分析，占细胞总蛋白量I%的蛋白其mRNA的比 例也常常 到总 RNA的1%左右 因此 目的cDNA克隆也将在 DNA 店中占到1% 对于DNA文库，我们同样采用DNA杂交或是兔疫分析方法来筛选带有某一特定基因的克隆。当然， 如果用免疫分析来筛选的话，克隆的cDNA必须置于一个细菌启动子的驱动之下以保证转录的顺利进行。 由于大多数克隆载体无法保证cDNA插入以后仍能维持正确的序列，因此，无论用哪种方法筛选到的阳性 克隆都应该作进一步的分析，以确定其是否带有编码目的蛋白的完整基因。 第五节其它几种基因文库 一、YAC文库 酵母人工染色体载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒，而臂上则有着丝点、自主复制序列等染色 体必备元件，除此之外，还有供选择的标记基因：当外源D片段连接进两个臂中以后，通过选择标记人 们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体。 酵母人工染色体可用于克隆在片段DNA(OI0Okb),高度稳定，己在制作生物体的基因组DNM的物理图 谱、大转录单位的分析、构建生物体的单个染色体的特殊核库等方面得到了应用。 YAC文库 是指应用YAC载体克隆较大DNA片段(>1OOKb),进而构建的包含某种生物基因组的全部基因 的无性繁殖系（克隆）的总称。 YAC文库特点 可以容钠较大的DNA片段：但构建YAC文库时投入巨大：箭选文库时需花费大量的人 力物力。 噬菌体文 以入噬菌体为载体，克隆一定大小的DNA片段(2025kb)所构建成的基因组文库。 构建入噬菌体文库的DA片段不能太大，也不能太小：在文库扩增时，由于克隆的生长速率不同，文 库的组成可能会出现某种潜在的改变。 λ噬菌体文库可用DA探针或是免疫分析进行筛选，只不过细菌文库形成单菌落，而噬菌体文库形成 单个噬菌斑 小 结 构建基因文库是指通过工具酶（限制性内切酶、连接酶）的作用，将外源DNA片段或反转录合成的©DNA 选用不同的载体进行克隆，常用的载体有质粒
5 克服这些局限性的方法是使用随机引物，这类引物是化学合成的 6 核苷酸的混合物，它们沿 RNA 链随 机退火，促进全长 cDNA 的合成。 三、cDNA 文库的筛选 最佳的 cDNA 文库应构建自目的 mRNA 高水平转录的组织或细胞。在高度分化的细胞中，某种特殊的 mRNA 分子可能占总 poly(A) mRNA 的 1/20，而有些 mRNA 则根本不存在或者在 100,000 个 poly(A) mRNA 分子中仅有 1 个，丰度极低。因此，当选择一个 cDNA 文库时，必须努力获得从待筛选的 mRNA 丰度较 高的细胞构建的 cDNA 文库。相应地，有待筛选的克隆数目要由细胞中 mRNA 的丰度来决定。细胞中某 种蛋白质的表达量常常是表明 mRNA 丰度的敏感指标。据分析，占细胞总蛋白量 1%的蛋白其 mRNA 的比 例也常常占到总 mRNA 的 1%左右。因此，目的 cDNA 克隆也将在 cDNA 文库中占到 1%。 对于 cDNA 文库，我们同样采用 DNA 杂交或是免疫分析方法来筛选带有某一特定基因的克隆。当然， 如果用免疫分析来筛选的话，克隆的 cDNA 必须置于一个细菌启动子的驱动之下以保证转录的顺利进行。 由于大多数克隆载体无法保证 cDNA 插入以后仍能维持正确的序列，因此，无论用哪种方法筛选到的阳性 克隆都应该作进一步的分析，以确定其是否带有编码目的蛋白的完整基因。 第五节 其它几种基因文库 一、YAC 文库 酵母人工染色体载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒，而臂上则有着丝点、自主复制序列等染色 体必备元件，除此之外，还有供选择的标记基因；当外源 DNA 片段连接进两个臂中以后，通过选择标记人 们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体。 酵母人工染色体可用于克隆在片段 DNA（>100kb），高度稳定，已在制作生物体的基因组 DNA 的物理图 谱、大转录单位的分析、构建生物体的单个染色体的特殊核库等方面得到了应用。 YAC 文库 是指应用 YAC 载体克隆较大 DNA 片段（>100Kb），进而构建的包含某种生物基因组的全部基因 的无性繁殖系（克隆）的总称。 YAC 文库特点 可以容纳较大的 DNA 片段；但构建 YAC 文库时投入巨大；筛选文库时需花费大量的人 力物力。 二、噬菌体文库 以λ噬菌体为载体，克隆一定大小的 DNA 片段（20-25kb）所构建成的基因组文库。 构建λ噬菌体文库的 DNA 片段不能太大，也不能太小；在文库扩增时，由于克隆的生长速率不同，文 库的组成可能会出现某种潜在的改变。 λ噬菌体文库可用 DNA 探针或是免疫分析进行筛选，只不过细菌文库形成单菌落，而噬菌体文库形成 单个噬菌斑。 小 结 构建基因文库是指通过工具酶（限制性内切酶、连接酶）的作用，将外源 DNA 片段或反转录合成的 cDNA 插入载体，并在宿主当中表达；进而通过探针杂交、免疫反应等方法筛选目的克隆。根据目的片段的大小 选用不同的载体进行克隆，常用的载体有质粒、λ噬菌体、酵母人工染色体等