第十章转基因动物技术 第一节转基因动物 一、概述 转基因动物(transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内， 并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其 特点是 于及细 泡水平操作，组织及动物整体水平 表 自1981年，美国的B rinser断和Palmiter获得世界上第一只转基因动物 “巨”以来 国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。2000年10月2日，转基因猴在美国俄勒冈保健科 学大学诞生。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因 鸡、兔、蚕等多种转基因动物。 二、转基因动物的基本原 转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物 的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的 胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物， 人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能：也可以通过转入外源基 因培有优良的动物品种 转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的 转录单位)。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因 (reporter gene)或报告序列(reporter sequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强 启动子（有时包括增强子），或者直接选用目的基因的天然启动子序列。 三、转基因动物的基本方法 L.显微注射法(microinjection) 显微注射是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接 注入实验动物受拮卵的原核。使外源基因整合到实验动物基因组中，从而得到转基因动物 优点是：导入基因的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大已达25Okb)。 转基因动物的 一般实验程序(P199) 2.胚胎干细胞法 (embryonic stem cells,ES细胞 胚胎干细胞是从若床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入 动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为 种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES细胞可通过硫酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。 3.逆转录病毒感染法 将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细 胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细 胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。 4.精子载体法 通过DNA与精子共有法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子 然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DN 的转基因个体。 5.转基因动物中外源DNA的检测
第十章 转基因动物技术 第一节 转基因动物 一、概述 转基因动物（transgenic animal）是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内， 并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其 特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。 自 1981 年，美国的 Brinster 和 Palmiter 获得世界上第一只转基因动物—“巨鼠”以来， 国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。2000 年 10 月 2 日，转基因猴在美国俄勒冈保健科 学大学诞生。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因 鸡、兔、蚕等多种转基因动物。 二、转基因动物的基本原理 转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物 的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的 胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物， 人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基 因培育优良的动物品种。 转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的 转录单位）。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因 (reporter gene)或报告序列(reporter sequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强 启动子（有时包括增强子）, 或者直接选用目的基因的天然启动子序列。 三、转基因动物的基本方法 1.显微注射法 （microinjection） 显微注射是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接 注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合到实验动物基因组中，从而得到转基因动物。 优点是：导入基因的速度快且操作简单，对 DNA 大小无限制（最大已达 250kb）。 转基因动物的一般实验程序（P199） 2.胚胎干细胞法 （embryonic stem cells， ES 细胞） 胚胎干细胞是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入 动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一 种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES 细胞可通过磷酸钙-DNA 共沉淀法、 逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。 3.逆转录病毒感染法 将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细 胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细 胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。 4.精子载体法 通过 DNA 与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源 DNA 的精子， 然后利用其进行受精，将外源 DNA 导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源 DNA 的转基因个体。 5.转基因动物中外源 DNA 的检测
染色体和基因水平Southern杂交、FISH、PCR等 转录水平：Northern杂交、RT-PCR等 蛋白质水平：Western blot 四、转基因动物的应用 ①对基因组织或阶段特异表达的研究 ②诵时研究转入外源基因后的新麦型，可以发现基因的新功能 ③导入外源基因后， 由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型 进行分析， 可以发现 ④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究： ⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型： ⑥对遗传性疾病的研究： ⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据 动物新品种的培育 ⑨基因产品的制备： ⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。 五、己建立的人类遗传病的转基因动物模型 第二节基因打靶 基因打靶（g geting)是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因 从而在生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除(gene knockout) 若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入(gene knock-in)。目前这种 技术主要在小鼠S细胞中进行。 我国科学家率先掌握“基因打靶”技术的是第二军医大学附属东方肝胆外科医院股正 丰教授。因为“基因打靶”是精确、 定点地改造动物基因组，而通常的转基因方法无法判 断和控制基因移往何处， 移植的后 果不可预测也不可控制，因此其具 有说 多好处 。如：安全 性正遭到怀疑的基因药物和转基因食品将更加安全，因为基因移植的位点是事先确定的，转 移后的副作用事先可避免。第二，通过控制基因移植，克隆动物也可以“优生优有”。第三， 通过“基因打靶”，可以有选择地将某些动物基因删除，并转入人的有关基因，这样培养出 来的动物器官可以避免排异反应，安全有效地移植到人体。 基因打靶的必备条件 1.胚胎干细胞 ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团， 即小鼠受精卵发育第4、5大 的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发有的全能性。S细胞体外贴壁生长 时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。 2.打靶载体打靶载体含有两种筛选标志：no(新霉素)阳性筛选标志：HSV一tk阴性 筛选标志，通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳 性率 (I)neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞 染色体上的同源序列发生同源重组时，no基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的 ES细胞能在含G418的培养基中生长
染色体和基因水平 Southern 杂交、FISH、PCR 等 转录水平:Northern 杂交、RT-PCR 等 蛋白质水平:Western blot 四、转基因动物的应用 ①对基因组织或阶段特异表达的研究； ②通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能； ③导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型 进行分析，可以发现新的基因； ④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究； ⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型； ⑥对遗传性疾病的研究； ⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； ⑧动物新品种的培育； ⑨基因产品的制备； ⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。 五、已建立的人类遗传病的转基因动物模型 第二节 基因打靶 基因打靶（gene targeting）是指通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因， 从而在生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）； 若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knock-in）。目前这种 技术主要在小鼠 ES 细胞中进行。 我国科学家率先掌握“基因打靶”技术的是第二军医大学附属东方肝胆外科医院殷正 丰教授。 因为“基因打靶”是精确、定点地改造动物基因组，而通常的转基因方法无法判 断和控制基因移往何处，移植的后果不可预测也不可控制，因此其具有许多好处。如：安全 性正遭到怀疑的基因药物和转基因食品将更加安全，因为基因移植的位点是事先确定的，转 移后的副作用事先可避免。第二，通过控制基因移植，克隆动物也可以“优生优育”。第三， 通过“基因打靶”，可以有选择地将某些动物基因删除，并转入人的有关基因，这样培养出 来的动物器官可以避免排异反应，安全有效地移植到人体。 一、基因打靶的必备条件 1.胚胎干细胞 ES 细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第 4、5 大 的胚泡细胞。ES 细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES 细胞体外贴壁生长 时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。 2.打靶载体 打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk 阴性 筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳 性率。 （1）neo 阳性筛选标志：将 neo 基因插入用于打靶的外源 DNA 中。当外源 DNA 与细胞 染色体上的同源序列发生同源重组时，neo 基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的 ES 细胞能在含 G 418 的培养基中生长
(2)HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒的胸腺密啶激座(thymidin kise)基因，它编码TK,TK除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸外，还可以催化一些单 核苷类似物磷酸化。 这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有很强毒性 将HSV-k基因插入外源基因外侧的载体序列中，当外源DA与细胞染色体上的同源序 列发生同源重组时，载体部分（含HSV-k基因）是不能被整合到染色体中的，转化细胞能 够在含G418和单核苷酸类似物的培养基上生长。如果细胞能在G418培养基上生长，但不 能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中。 二、基因敲除的基本程厅 打靶载体的构建一打靶载体导入ES细胞一·将基因敲除ES细胞注射入胚泡一胚泡 植入假孕小鼠的子宫中一嵌合体的杂交育种 三、基因打靶在医学中的应用 1.基因打与遗传病 遗传病是直接由遗传物质发生改变所造成的，如基因突变或染色体畸变等。基因打靶技 术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传，桶过热 因打靶途径建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），是研究疾病的发生机制、分 子其础及诊断的主题动物型 2.基因打靶与肿瘤的研究 利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性 生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。 3.基因打靶与生物制药国外有家制药公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因 从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球 蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会 和经济价值是无法估量的。 四、基因打靶的应用举例 基因鼓出 为了研究MCI分子的功能，有人构建了含有10bb2微球蛋白基因序列的载体，并 将N0抗性基因插入第二个内含子中，将它转移到ES细胞中与内源b2微球蛋白基因发生 可源重组，通过正-负筛选法得到了转基因的ES细胞，鼠内源的2微球蛋自基因的功能被 破坏，在得到的转基因纯合鼠完全缺失了CI,但其发育与野生型无区别，由此证明， HCI在发育过程中毫无作用，但转基因纯合鼠缺少CD8+T细跑，因此对病毒感染的抵抗 力非常低，表明细胞兔疫出理缺路。 基因入 家蚕娟丝腺做生物反应器 第三节转基因植物 生物安全性问题 在生物安全性方面人们主要考虑以下8个问题：①转基因植物的扩散问题：②转入植物的外 源基因的扩散问题：③转入植物的其他标记基因（如抗生素抗性基因）的扩散问题：④转基因 植物是否会影响生物多样性，即生物“入侵”问题：⑤转基因植物是否会改变与之相关物种
（2）HSV-tk 阴性筛选标志：HSV-tk 是来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因，它编码 TK，ＴＫ除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸外，还可以催化一些单 核苷类似物磷酸化，这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有很强毒性。 将 HSV-tk 基因插入外源基因外侧的载体序列中，当外源 DNA 与细胞染色体上的同源序 列发生同源重组时，载体部分（含 HSV-tk 基因）是不能被整合到染色体中的，转化细胞能 够在含 G 418 和单核苷酸类似物的培养基上生长。如果细胞能在 G418 培养基上生长,但不 能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中。 二、基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 → 打靶载体导入 ES 细胞 → 将基因敲除 ES 细胞注射入胚泡 → 胚泡 植入假孕小鼠的子宫中 → 嵌合体的杂交育种 三、基因打靶在医学中的应用 1.基因打靶与遗传病 遗传病是直接由遗传物质发生改变所造成的，如基因突变或染色体畸变等。基因打靶技 术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。通过基 因打靶途径建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），是研究疾病的发生机制、分 子基础及诊断的主要动物模型。 2.基因打靶与肿瘤的研究 利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性 生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。 3.基因打靶与生物制药 国外有家制药公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因 从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球 蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会 和经济价值是无法估量的。 四、基因打靶的应用举例 基因敲出 为了研究 MHC I 分子的功能，有人构建了含有 10kb b2 微球蛋白基因序列的载体，并 将 Neo 抗性基因插入第二个内含子中，将它转移到 ES 细胞中与内源 b2 微球蛋白基因发生 同源重组，通过正-负筛选法得到了转基因的 ES 细胞，鼠内源的 b2 微球蛋白基因的功能被 破坏，在得到的转基因纯合鼠完全缺失了 MHC I，但其发育与野生型无区别，由此证明， MHC I 在发育过程中毫无作用，但转基因纯合鼠缺少 CD8+T 细胞，因此对病毒感染的抵抗 力非常低，表明细胞免疫出现缺陷。 基因敲入 家蚕娟丝腺做生物反应器 第三节 转基因植物 生物安全性问题 在生物安全性方面人们主要考虑以下 8 个问题：①转基因植物的扩散问题；②转入植物的外 源基因的扩散问题；③转入植物的其他标记基因(如抗生素抗性基因)的扩散问题；④转基因 植物是否会影响生物多样性，即生物“入侵”问题；⑤转基因植物是否会改变与之相关物种
(如害虫)的进化速度：⑥转基因植物中标记基因的毒性问题：⑦转基因植物的果实或其他部 分作为食物是否会引起食用者产生不良反应，特别是有无可积累的长期作用：⑧转基因植物 是否会对农业和国际贸易带来一些不可预测的影响
(如害虫)的进化速度；⑥转基因植物中标记基因的毒性问题；⑦转基因植物的果实或其他部 分作为食物是否会引起食用者产生不良反应，特别是有无可积累的长期作用；⑧转基因植物 是否会对农业和国际贸易带来一些不可预测的影响