任何待测DNA序列的片段克隆于上述载体后，都 可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷 酸片段作为“通用引物”，该类引物可以与载体 DNA序列互补结合，并以待测DNA为模板引导合 成新生链，用双脱氧终止法进行序列测定
任何待测DNA序列的片段克隆于上述载体后，都 可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷 酸片段作为“通用引物” ，该类引物可以与载体 DNA序列互补结合，并以待测DNA为模板引导合 成新生链，用双脱氧终止法进行序列测定
载体 DNA片段 酶切，连接 设计通用引物
载体 DNA片段 酶切，连接 设计通用引物
2、大片段DNA序列测定的策略 (1)鸟枪法将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定 的片段（300-600bp)，断裂方法有超声波处理、核酸酶 法和限制酶切割法。 (2)嵌套缺失法(nested deletion,Erase-a-base) ①首先将大片段克隆到测序载体； ②选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将 DNA切断，使切割后近载体端为3突出的粘性末端，近待 测DNA的末端为5突出的粘性末端或平端；
（1）鸟枪法 将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定 的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶 I法和限制酶切割法。 （2）嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base） ①首先将大片段克隆到测序载体； ②选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将 DNA切断,使切割后近载体端为3`突出的粘性末端，近待 测DNA的末端为5`突出的粘性末端或平端； 2、大片段DNA序列测定的策略
③用外切核酸酶Ⅲ消化上述线性DNA（37°C,250核苷酸 mi),在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并 依次相差200-250bp的DNA片段。 ④用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4DNA连 接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆； ⑤将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相 同，测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地 将相邻片段的序列拼接起来
③用外切核酸酶III消化上述线性DNA（37C，250核苷酸 /min），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并 依次相差200-250bp的DNA片段。 ④用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4 DNA连 接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆； ⑤将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相 同，测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地 将相邻片段的序列拼接起来
目的片段 引物 BamH I
引物 E B 目的片段 B E BamH I