第八章基因芯片 第一节概述 DNA芯片也叫基因芯片(Gene chip)是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密 度地（点间距<500μm)排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸，也叫探针。这些被固定的分子 探针在基质上形成 高密度的DNA微阵列，因此， DNA芯片又叫DNA微矩阵(DNA Microarray）。第 块基因芯片1992年诞生在美 DNA芯片属于生物芯片(biochip)的范畴，生物芯片分为DNA芯片、蛋白质芯片及 其它芯片（样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片等）三类。 第二节DNA芯片的基本原理 l.基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的，可以说它是Southern blot的改进和发展， 它的原理是：变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双 薛杂交分子。 S:DNA-DNA/RNA N:RNA-DNA/RNA W:Protein-protein/DNA: E:Genome DNA-DNA/RNA (Dot blot) 2.基因芯片与Southern blot之比较 基因芯片的基本原理与Southern blot技术一脉相承，点样技术和数据读取技术的发展是 基因芯片技术对传统核酸杂交的技术性突破，因此，基因芯片技术是基因功能研究领域的一 次革命。通过基因芯片人们可以大规模、高通量（海量）地对成千上万个基因进行同时研究。 与Southern blot相比较，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自动化的特 点。 3.基因芯片基本操作流程 制备总RNA→mRNA经RT-PCR用Cy3(正常对照组)和Cy5(实验组)荧光标记目 的基因，得到cDNA探针一混合标记探针一与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交 扫描一分析杂交结果一结论 载体+寡核苷酸探针分子+荧光染料点样仪扫描仪计算机+专业软件 第三节DNA芯片的种类 一、表达谱基因芯片 用于基因功能的研究。原理：用不同的荧光染料通过RT-PCR标记不同来源的细刷 mRNA制备成探针，将探针混合后与芯片上的基因杂交、洗涤、扫描，得到这些基因在不 同组织或个体中的表达诺 ,再通过计算机分析这 基因在不同组织或个体中的表达差异，得 出这些基因表达的重要信息。即高表达、低表达或不表达。 二、诊断芯片 在DNA和/或RNA水平上用于疾病诊断，如肝癌、糖尿病等
第八章 基因芯片 第一节 概述 DNA芯片也叫基因芯片（Gene chip）是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密 度地（点间距<500m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸,也叫探针。这些被固定的分子 探针在基质上形成高密度的DNA微阵列，因此，DNA芯片又叫DNA微矩阵（ DNA Microarray）。第一块基因芯片1992年诞生在美国。 DNA 芯片属于生物芯片（biochip）的范畴，生物芯片分为 DNA 芯片、蛋白质芯片及 其它芯片（样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片等）三类。 第二节 DNA 芯片的基本原理 1.基因芯片技术是建立在 Southern blot 基础之上的，可以说它是 Southern blot 的改进和发展， 它的原理是：变性 DNA 加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双 链杂交分子。 S； DNA-DNA/RNA； N：RNA-DNA/RNA； W：Protein-protein/DNA； E：Genome DNA-DNA/RNA（Dot blot） 2.基因芯片与 Southern blot 之比较 基因芯片的基本原理与 Southern blot 技术一脉相承，点样技术和数据读取技术的发展是 基因芯片技术对传统核酸杂交的技术性突破，因此，基因芯片技术是基因功能研究领域的一 次革命。通过基因芯片人们可以大规模、高通量（海量）地对成千上万个基因进行同时研究。 与 Southern blot 相比较，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自动化的特 点。 3. 基因芯片基本操作流程 制备总 RNA→ mRNA 经 RT-PCR 用 Cy3（正常对照组）和 Cy5（实验组）荧光标记目 的基因，得到 cDNA 探针→ 混合标记探针→与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交→ 扫描→分析杂交结果→结论 载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪-扫描仪-计算机+专业软件 第三节 DNA 芯片的种类 一、表达谱基因芯片 用于基因功能的研究。原理：用不同的荧光染料通过 RT-PCR 标记不同来源的细胞 mRNA 制备成探针，将探针混合后与芯片上的基因杂交、洗涤、扫描，得到这些基因在不 同组织或个体中的表达谱，再通过计算机分析这些基因在不同组织或个体中的表达差异，得 出这些基因表达的重要信息。即高表达、低表达或不表达。 二、诊断芯片 在 DNA 和/或 RNA 水平上用于疾病诊断，如肝癌、糖尿病等
三、检芯片 HBV、HCV、结核杆菌等病原体检测，商检等 第四节基因芯片的应用 一、杂交测序和基因作图 杂交测序 (SBH)是发展基因芯片技术的初衷，希望能够提供一种新的、快速的测序方 法。原理：理论上有4个长度为的序列，可以被分析的目标长度大约等于点阵上寡核苷 酸数目的平方根。 基因绘图：用光蚀刻技术在载体上合成大规模有序的寡核苷酸序列（标签序列），然后 与克隆文库中的每个克隆进行杂交，通过鉴定基因与基因间的大量标签序列(EST,STS等)， 以较低的等价基因组数把他们绘制成重叠图。 附：标签序列 expressed sequence tags,.ST表达序列标签，为cDNA的部分序列，平均为300-500bp,它 可以确定基因的种类和所代表基因表达的拷贝数。目前，公共数据库中可利用的人类EST 超过100万个，它可能代表所有人类基因的50%-90%。 序列标签位点，是指染色体定位明确，而且可以用PCR扩增的单 般每隔100kb距离就有一个标记 二、检测基因突变 如果基因易发生突变区段的核苷酸序列是已知的，则DNA芯片能很容易地通过再测序 鉴别出仅1个碱基的错配。以下面的15的探针为例，每个探针只有中间一个核苷酸不同， 以红体下划线表示 1.GCTACTCATGCGTAC 2.CTACTCAIGCGTACT 3.TACTCATGCGTACTC 5. CTCATGCGT AC T C CG 6.TCATGCGIACTCCGT 三、基因表达分析 1、肺癌相关基因的表达研究 黄达辉毛裕民等 用含4O96条©DNA基因的表达谱芯片研究一组肺癌组织样本的基因表达谱，共筛选出 差异表达的基因 370条 包含已知基因146条 ,未知基因224条，其中107条表达增加，263 条表达降低。（第二军医大学学报，2000,21(9）：827-830 2、基因芯片对PMA激活的血管内皮细胞早期反应基因的研究吴超群，李瑶，毛裕民， 描要：用含4096条人举基因的DNA芯片研究PMA激活的血管内皮细胞ERG的表达普 作用6仙后，17条基因 表达上 ，11条基因下调。数据分析表明1 条上调基因中13条属于 蛋白质磷酸酶和转录调控因子基因，而下调基因中9条为细胞分裂相关蛋白，从而证明PM 激活的人血管内皮细胞ERG主要是转录调控因子基因和蛋白质磷酸酶基因。 四、基因芯片在肿瘤研究中的应用
三、检测芯片 HBV、HCV、结核杆菌等病原体检测，商检等。 第四节 基因芯片的应用 一、杂交测序和基因作图 杂交测序（SBH）是发展基因芯片技术的初衷，希望能够提供一种新的、快速的测序方 法。原理：理论上有 4 n 个长度为 n 的序列，可以被分析的目标长度大约等于点阵上寡核苷 酸数目的平方根。 基因绘图：用光蚀刻技术在载体上合成大规模有序的寡核苷酸序列（标签序列），然后 与克隆文库中的每个克隆进行杂交，通过鉴定基因与基因间的大量标签序列（EST，STS 等）, 以较低的等价基因组数把他们绘制成重叠图。 附：标签序列 expressed sequence tags, EST: 表达序列标签，为 cDNA 的部分序列，平均为 300-500bp，它 可以确定基因的种类和所代表基因表达的拷贝数。目前，公共数据库中可利用的人类 EST 超过 100 万个，它可能代表所有人类基因的 50%-90%。 sequence tagged site,STS: 序列标签位点，是指染色体定位明确，而且可以用 PCR 扩增的单 拷贝序列，一般每隔 100kb 距离就有一个标记。 二、检测基因突变 如果基因易发生突变区段的核苷酸序列是已知的，则 DNA 芯片能很容易地通过再测序 鉴别出仅 1 个碱基的错配。以下面的 15nt 的探针为例，每个探针只有中间一个核苷酸不同， 以红体下划线表示。 1. G C T A C T C A T G C G T A C 2. C T A C T C A T G C G T A C T 3. T A C T C A T G C G T A C T C 4. A C T C A T G C G T A C T C C 5. C T C A T G C G T A C T C C G 6. T C A T G C G T A C T C C G T 三、基因表达分析 1、肺癌相关基因的表达研究 黄达辉 毛裕民等 用含 4096 条 cDNA 基因的表达谱芯片研究一组肺癌组织样本的基因表达谱，共筛选出 差异表达的基因 370 条，包含已知基因 146 条，未知基因 224 条，其中 107 条表达增加，263 条表达降低。（第二军医大学学报，2000，21（9）：827-830） 2、基因芯片对 PMA 激活的血管内皮细胞早期反应基因的研究 吴超群，李瑶，毛裕民， 等. 摘要：用含 4096 条人类基因的 DNA 芯片研究 PMA 激活的血管内皮细胞 ERG 的表达谱， 作用 6h 后，17 条基因表达上调，11 条基因下调。数据分析表明 17 条上调基因中 13 条属于 蛋白质磷酸酶和转录调控因子基因，而下调基因中 9 条为细胞分裂相关蛋白，从而证明 PMA 激活的人血管内皮细胞 ERG 主要是转录调控因子基因和蛋白质磷酸酶基因。 四、基因芯片在肿瘤研究中的应用
1、)寻找肿瘤相关基因 elford等结合消减杂交技术用基因芯片分析了两例具有不同生物学活性的Ewing肉 痘标 例为生长迅速的转移灶，另 一例为被成功治愈的局限， 经差异表达后，将消 插入质粒，制成cDNA ,文库，与不同荧光标记的肉瘤组织杂交，共得到173条差异表达的基因 其中有50条为新基因(28.9%). 2、种南基因表状普研究 Kon0nen等用含有4000条已知某因和2000个EST的cDNA芯片对两株分别为激素依 CWR2)和非微素依载 细胞迷 杂交，将其表达谱与269例前列腺 癌组织 正常前列腺组织 找设现片器吸系因中有3条西0注非微瓷 中表达超过2倍，有135条基因(2.6%下调超过50%其中上调的IGFBP2和HSP27基因在临 床激素抵抗复发肿瘤标本中分别有100%和31%也是上调的。 3、瘤分子生物学研究 Aiz3dh签用基因片对DBd B-cell lymph 1)进行的病理分型研究 发现，依据基因表达差异.DLBCL还可以分为三个亚型.(Narc,200,403503-5D 4、肼霜诊圈 国外有一个病人临床表现出典型的白血病症状，但形态学检测不典型，根据相关检查 诊断为AML(acute myeloid leukaemia),治疗几个月后未见好转。后来用DNA芯片与 高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤， 改变治疗方案，病情出现缓解 五、基因款片在药物研究中的应用 1、药物筛选 直接检测化合物对生物大分子如受体、酶、离子通道等的结合及作用：检测化合物作用 于细胞后基因表达变化：选择合适的药物作用靶标 有人用5,766个基因的芯片分析正常与癌变的卵巢组织的mRNA,发现二者有30%的基因 表达差异为2倍以上，其中癌变组织9%的基因表达上调，尤以CD9、上皮糖蛋白、P27蛋白 2、指导合理用药 不同个体结合药物的靶标存在差异：小分子药物在体内的作用靶标不可能有绝对专 性。 六、基因芯片在微生物菌种鉴定中的应用 菌种鉴定、细菌基因分型及菌种鉴定、监测细菌抗药性基因 七、基因芯片在病原体致病机制中应用 1、致病机制研究 研究病原体基因组，了解其致病基因，抗药机制及抗药基因等：分析药物作用下病原体基因 表达情况：监测宿主在染病状态下基因表达的变化。 2、病原体致病机制的研究 1996年K0 l等首次用基因芯片技术发现ⅢV1包膜B蛋白酶极其多变，其中许多氨 基酸的改变与抗蛋白酶抑制剂的抗药性有关。 八、基因芯片在军事司法方面的应用
1、）寻找肿瘤相关基因 Welford 等结合消减杂交技术,用基因芯片分析了两例具有不同生物学活性的 Ewing 肉 瘤标本,一例为生长迅速的转移灶,另一例为被成功治愈的局限灶。经差异表达后,将消减文库 插入质粒,制成 cDNA 文库,与不同荧光标记的肉瘤组织杂交,共得到 173 条差异表达的基因, 其中有 50 条为新基因（28.9%）。 2、肿瘤基因表达谱研究 Kononen 等用含有 4000 条已知基因和 2000 个 EST 的 cDNA 芯片对两株分别为激素依 赖(CWR22)和非激素依赖(CWR22R)的前列腺癌细胞进行杂交,将其表达谱与 269 例前列腺 癌组织及正常前列腺组织比较,发现在芯片的 5148 条基因中,有3 条基因(0.7%)在非激素依赖 中表达超过 2 倍,有 135 条基因(2.6%)下调超过 50%,其中上调的 IGFBP2 和 HSP27 基因在临 床激素抵抗复发肿瘤标本中分别有 100% 和 31%也是上调的。 3、瘤分子生物学研究 Alizadeh 等用基因芯片对 DLBCL(diffuse large B-cell lymphoma )进行的病理分型研究 发现,依据基因表达差异,DLBCL 还可以分为三个亚型.（Nature, 2000,403:503-511）。 4、肿瘤诊断 国外有一个病人临床表现出典型的白血病症状，但形态学检测不典型，根据相关检查， 诊断为 AML （acute myeloid leukaemia） ，治疗几个月后未见好转。后来用 DNA 芯片与 病人骨髓的 mRNA 杂交，结果显示 AML 和 ALL(acute lymphoblastic leukaemia)基因都表达 较低，而在数据分析中发现，编码原肌球蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤， 改变治疗方案，病情出现缓解。 五、基因芯片在药物研究中的应用 1、药物筛选 直接检测化合物对生物大分子如受体、酶、离子通道等的结合及作用；检测化合物作用 于细胞后基因表达变化；选择合适的药物作用靶标。 有人用 5,766 个基因的芯片分析正常与癌变的卵巢组织的 mRNA，发现二者有 30%的基因 表达差异为 2 倍以上，其中癌变组织 9%的基因表达上调，尤以 CD9、上皮糖蛋白、P27 蛋白 等。 2、指导合理用药 不同个体结合药物的靶标存在差异；小分子药物在体内的作用靶标不可能有绝对专一 性。 六、基因芯片在微生物菌种鉴定中的应用 菌种鉴定、细菌基因分型及菌种鉴定、监测细菌抗药性基因 七、基因芯片在病原体致病机制中应用 1、致病机制研究 研究病原体基因组，了解其致病基因，抗药机制及抗药基因等；分析药物作用下病原体基因 表达情况；监测宿主在染病状态下基因表达的变化。 2、病原体致病机制的研究 1996 年 Kozal 等首次用基因芯片技术发现 HIV-1 包膜 B 蛋白酶极其多变，其中许多氨 基酸的改变与抗蛋白酶抑制剂的抗药性有关。 八、基因芯片在军事司法方面的应用
检测生物战病原体，研制生物战保护剂：DNA指纹鉴定、血型鉴。 I)DNA指纹 DNA fingerprint:人类基因组内散布者许多串联重复的短小DNA序列，叫小卫星DN (MSDNA),由于不受选择压力，卫星DNA呈现高度的多态性，具有孟德尔式稳定遗传的 特性。因此，用MSDNA探针与总DNA限制性酶切片段（酶切位点在MSDNA之外）杂交， 可以得到个体特异的DNA指纹图谱。 第五节数据分析 1.图象分析(Image analysis) 2.标准化处理(Normalization):是指以持（管）家基因(housekeeping gene)的表达率为参 照，对原始数据进行校正的过程。实际操作中常常剔除Cy3和Cy5信号强度均小于40的 基因表达，使数据标准化。 3.散点图分析(scatter plot) 基因芯片的扫描示意图、基因芯片扫描结果图 4 Ratio值分析Ratio=Cv3/Cv5.一般认为Ratio值在05-20范围内（即2倍以下）的基因 不存在显著表达差异，该范围之外的基因表达认为具有显著差异， 由干实哈件不同出域 值区间会根据可信度有所调整 5.聚类分析(Clustering):就是根据统计分析原理对具有相同统计行为的多个基因或样本进 行归类的分析方法，归为一类（簇）的基因或样本可能具有相似的功能或类型。 聚类示意图 第六节基因芯片的发展与展望 2003年HGP完成后，人们面临的问题是如何了解10万条基因中每一个基因的功能， 以及基因之间的相互关系等。从而行生出人类基因组多样性计别、环墙基因组学、肿扇基因 解剖学计划、药物基因组学等。基因芯片以其无可比拟的高信息量、高通量、高自动化和快 速准确的优势必将成为后基因组时代最重要最常用的技术，因此，它被誉为微缩芯片实 至(lab-in-a-chp）a 一、中药开发 中医药体系一直是在“整体观念，讲证施治理论指导下完善发展而成的，现代医学也正 是朝“整体观念，辨证施治的方向发展。因此，中医药里既有巨大的宝藏，又有无限的商机。 基因芯片为中医药的研究提供了平行、快速、高通量、多参数的研究手段和筛选方法， 大黄治疗糖尿病、全反式维甲酸、三氧化二砷治疗白血病 二、SNPs(single nucleotide polymorphisms 染色体的某个位点上存在单个碱基的变化如果在人群中的频率超过1%，则认为是单核 酸多本(sNp ,SNPs是近年来出现的第三代遗传标记。另两个是RFLP,MSDNA 途：1)基因连锁分析，用于基因作图和疾病基因定位：2)人群中寻找SNPs位点：3)检 测保守基因中的点突变：4)病例与对照间的相关分析等。 SNPs分析的前提是所研究基因的DNA序列必须是已知的
检测生物战病原体，研制生物战保护剂；DNA 指纹鉴定、血型鉴。 1) DNA 指纹 DNA fingerprint：人类基因组内散布着许多串联重复的短小 DNA 序列，叫小卫星 DNA （MSDNA），由于不受选择压力，卫星 DNA 呈现高度的多态性，具有孟德尔式稳定遗传的 特性。因此，用 MSDNA 探针与总 DNA 限制性酶切片段（酶切位点在 MSDNA 之外）杂交， 可以得到个体特异的 DNA 指纹图谱。 第五节 数据分析 1.图象分析（Image analysis） 2.标准化处理（Normalization）: 是指以持（管）家基因（housekeeping gene）的表达率为参 照，对原始数据进行校正的过程。实际操作中常常剔除 Cy3 和 Cy5 信号强度均小于 400 的 基因表达，使数据标准化。 3.散点图分析（scatter plot） 基因芯片的扫描示意图、基因芯片扫描结果图 4.Ratio 值分析 Ratio=Cy3/Cy5, 一般认为 Ratio 值在 0.5-2.0 范围内（即 2 倍以下）的基因 不存在显著表达差异，该范围之外的基因表达认为具有显著差异，由于实验条件不同，此域 值区间会根据可信度有所调整。 5.聚类分析（Clustering ）:就是根据统计分析原理对具有相同统计行为的多个基因或样本进 行归类的分析方法，归为一类（簇）的基因或样本可能具有相似的功能或类型。 聚类示意图 第六节 基因芯片的发展与展望 2003 年 HGP 完成后，人们面临的问题是如何了解 10 万条基因中每一个基因的功能， 以及基因之间的相互关系等，从而衍生出人类基因组多样性计划、环境基因组学、肿瘤基因 解剖学计划、药物基因组学等。基因芯片以其无可比拟的高信息量、高通量、高自动化和快 速准确的优势必将成为后基因组时代最重要最常用的技术，因此，它 被誉为“微缩芯片实验 室”(lab-in-a-chip)。 一、中药开发 中医药体系一直是在“整体观念，辨证施治”理论指导下完善发展而成的，现代医学也正 是朝“整体观念，辨证施治”的方向发展。因此，中医药里既有巨大的宝藏，又有无限的商机。 基因芯片为中医药的研究提供了平行、快速、高通量、多参数的研究手段和筛选方法。 大黄治疗糖尿病、全反式维甲酸、三氧化二砷治疗白血病 二、SNPs(single nucleotide polymorphisms) 染色体的某个位点上存在单个碱基的变化如果在人群中的频率超过 1%，则认为是单核 苷酸多态（SNPs）。SNPs 是近年来出现的第三代遗传标记。另两个是 RFLP，MSDNA；用 途：1）基因连锁分析，用于基因作图和疾病基因定位；2）人群中寻找 SNPs 位点；3）检 测保守基因中的点突变；4）病例与对照间的相关分析等。 SNPs 分析的前提是所研究基因的 DNA 序列必须是已知的