第六章 基因文库构建与筛选 卜友泉 基础医学院生物化学与分子生物学教研室
第 六 章 基因文库构建与筛选 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 卜友泉
1、cDNA文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库 的概念及其特点 2、基因文库概念及其意义 3、构建cDNA文库的流程及其筛选
1、 cDNA文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库 的概念及其特点 3、构建cDNA文库的流程及其筛选 2、基因文库概念及其意义
第一节工具酶、克隆载体 一、工具酶 分子克隆工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切 割、修饰、扩增、核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多 数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体，有少数酶则是来自动 物和动物病毒。 限制性内切酶限制性内切酶是一类主要分离于原核生物，能够识别双链 DNA(s-DNA)分子中特定核苷酸序列并将其切断的酶，常常简称为限制酶 (restriction enzymes). T4DNA连接酶T4DNA连接酶(T4 DNA Ligase)是分子克隆实验中最常用 的工具酶之一，该酶催化双链DNA分子中相邻的3'羟基和5'磷酸基间磷 酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以 连接两个具有平末端的DNA片段
分子克隆工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切 割、修饰、扩增、核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多 数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体, 有少数酶则是来自动 物和动物病毒。 限制性内切酶 限制性内切酶是一类主要分离于原核生物, 能够识别双链 DNA(ds-DNA)分子中特定核苷酸序列并将其切断的酶, 常常简称为限制酶 (restriction enzymes)。 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)是分子克隆实验中最常用 的工具酶之一，该酶催化双链DNA 分子中相邻的3'-羟基和5'-磷酸基间磷 酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以 连接两个具有平末端的DNA片段。 第一节 工具酶、克隆载体 一、工具酶
DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA或RNA作为模板合成 新的DNA链，这些新合成的链或是用于DNA标记，或是用于DNA序列分析， 或是用于DNA重组，或是用于某些感兴趣的DNA片段的扩增。因此，不 同的DNA聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。 磷酸酶将DNA末端中的5端磷酸基除去，使其5？端变成0H基。该酶有2 个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体 分子的自我连接；另外和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。 T4核苷酸激酶 广泛用于DNA和RNA的5'末端标记，标记时以[r-3P] ATP作为底物。采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必 须除去5'端未标记磷酸基
DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA或RNA作为模板合成 新的DNA链，这些新合成的链或是用于DNA标记，或是用于DNA序列分析， 或是用于DNA重组，或是用于某些感兴趣的DNA片段的扩增。 因此，不 同的DNA聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。 磷酸酶 将DNA末端中的5‘端磷酸基除去，使其5’端变成OH基。该酶有2 个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体 分子的自我连接；另外和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。 T4核苷酸激酶 广泛用于DNA和RNA的5'末端标记，标记时以[r- 32P] ATP 作为底物。采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必 须除去5'端未标记磷酸基
末端脱氧核苷酸转移酶主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末 端加上一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补 (即A和T,C和G)的尾巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互 补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶I一种非特异性的DNA内切酶，能降解双链DNA为5'磷 酸低聚核苷酸。DNaseI的酶活性需要二价阳离子作为辅助因子。其中 ,Ca艹和Mg艹或Ca艹和Mn艹使该酶达到最大活性。 核酸酶在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用RNA分子，最常用 的RNA酶有以下两种：RNaseA作用于RNA的专一性内切酶，它特异性 地作用于嘧啶核苷酸，该酶主要用于除去DNA制备物中的RNA
末端脱氧核苷酸转移酶 主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末 端加上一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补 (即A和T，C和G)的尾巴后， 经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互 补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶I 一种非特异性的DNA内切酶，能降解双链DNA为5'磷 酸低聚核苷酸。DNaseI的酶活性需要二价阳离子作为辅助因子。其中 ， Ca++和Mg++或Ca++和Mn++使该酶达到最大活性。 核酸酶 在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用RNA分子，最常用 的RNA酶有以下两种：RNaseA 作用于RNA的专一性内切酶，它特异性 地作用于嘧啶核苷酸，该酶主要用于除去DNA制备物中的RNA