第九章基因工程与干细胞工程 引言 140多年前(1865)，在捷克莫勒温镇一个修道院里沉醉于豌豆杂交实验的Mendel也许 根本就没有想到，他提出的遗传因子在半个世纪后被Morgen定义为基因：194年Avcy证 明了基因的物质基础是DNA:20世纪50年代初Watson和Crick又揭示了DNA的分子结构： 70年代初DNA己可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。生命科 的飞速发 孕有了现代分子生物 术 一基因工程。今天，人们在超市货架上可以买到保持期很长 转基因土豆，“多利”克隆绵羊走出实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变 革。 一、基因工程的基本概今 现在，关于基因工程的概念，不同的学者和不同的专著有不同的解释，很难有一个标准 的、准确的和固定的概念，而且，随者学科的发展，其内涵还在不断的扩展和延伸。就现在 的学科发展情况，可作以下阐述。同时，有必要对其相关的几个概念作一阐述。 (一)遗传工程、基因工程与生物工程的定义 l、遗传工程(Genetie en 七十年代才开始发展起 的一门新技术，是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分 子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。也是遗传学和工程学相结合的一门技术 科学。借用工程技术上的概念和设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA分子进行按图施工的遗传操作，以求定向改造生物的遗传特性。这一先进技术的兴起， 标志若现代遗传学或生物科学已发展到定向控制和改造遗传或生物性状的新阶段。 遗传工程可分为狭义和 一义两种 ()狭义的遗传工程即基因工程 (2)广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等 2、基因工程(Genetic Engineering) 原称遗传工程，又称基因操作(gene manipulation)、重组DNA(recombinant DNA) 基因工程是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，将一种或多种生物体（供 体)的基因与 载体在体外进行拼接重组构建成杂种D NA乡 然后转入另一种生物体（受 体)内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状，获得新品种，生产新产品，或是 究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体 而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数NA病毒外，几乎所有生物的基因都存在 于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程亦称为 重组DNA转术(DNA Reco 另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制制 增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖(Molecular Cloning) 3、生物工程(Biotechnology), 又称生物技术、生物工艺学。也是20世纪0年代诞生的一门新型技术。是根据生物学 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而 利用生物体所具有的功能元件（如基因、蛋白质等）来提供商品或社会服务的一门综合性科 学技术 生物工程被看作为新技术的革命标志之一，它与电子信息技术、新材料和新能源等技术 并列，成为关系到人类生存和社会进步、发展的世界高技术领域的重要支柱。这不仅因为它 所研究与开发的对象是可以再生的生物资源，而且还因为它对当今人类面临的人口和食物
第九章 基因工程与干细胞工程 引言 140 多年前（1865），在捷克莫勒温镇一个修道院里沉醉于豌豆杂交实验的 Mendel 也许 根本就没有想到，他提出的遗传因子在半个世纪后被 Morgen 定义为基因；1944 年 Avery 证 明了基因的物质基础是 DNA；20 世纪 50 年代初 Watson 和 Crick 又揭示了 DNA 的分子结构； 70 年代初 DNA 已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。生命科学的飞速发展 孕育了现代分子生物学技术——基因工程。今天，人们在超市货架上可以买到保持期很长的 转基因土豆，“多利”克隆绵羊走出实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变 革。 一、基因工程的基本概念 现在，关于基因工程的概念，不同的学者和不同的专著有不同的解释，很难有一个标准 的、准确的和固定的概念，而且，随着学科的发展，其内涵还在不断的扩展和延伸。就现在 的学科发展情况，可作以下阐述。同时，有必要对其相关的几个概念作一阐述。 （一）遗传工程、基因工程与生物工程的定义 1、 遗传工程（Genetic Engineering） 七十年代才开始发展起来的一门新技术，是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分 子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。也是遗传学和工程学相结合的一门技术 科学。借用工程技术上的概念和设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作，以求定向改造生物的遗传特性。这一先进技术的兴起， 标志着现代遗传学或生物科学已发展到定向控制和改造遗传或生物性状的新阶段。 遗传工程可分为狭义和广义两种： (1)狭义的遗传工程即基因工程 (2)广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等 2、基因工程（Genetic Engineering） 原称遗传工程，又称基因操作（gene manipulation）、重组 DNA（recombinant DNA）。 基因工程是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，将一种或多种生物体（供 体）的基因与载体在体外进行拼接重组构建成杂种 DNA 分子，然后转入另一种生物体（受 体）内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状，获得新品种，生产新产品，或是研 究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体 而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数 RNA 病毒外，几乎所有生物的基因都存在 于 DNA 结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是 DNA 分子，因此基因工程亦称为 重组 DNA 技术（DNA Recombination）。另外，DNA 重组分子大都需在受体细胞中复制扩 增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecular Cloning）。 3、生物工程（Biotechnology）， 又称生物技术、生物工艺学。也是 20 世纪 70 年代诞生的一门新型技术。是根据生物学、 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而 利用生物体所具有的功能元件（如基因、蛋白质等）来提供商品或社会服务的一门综合性科 学技术。 生物工程被看作为新技术的革命标志之一，它与电子信息技术、新材料和新能源等技术 并列，成为关系到人类生存和社会进步、发展的世界高技术领域的重要支柱。这不仅因为它 所研究与开发的对象是可以再生的生物资源，而且还因为它对当今人类面临的人口和食物
能源和资源以及环境和健康等迫切需要解决的问题发挥重要的作用，并展现了极其诱人的前 景。生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程等 (D基因工程(ene)又称基因操作(ene入重组DNA( DNA)。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导 入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和 功能」 (2)细胞工程()应用细胞生物学的原理和方法， 结 工程学的技术手段 按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖 细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、 染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微 生物工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。 (3)细胞分泌工程是根据细内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技 术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因 等措施，促进基因产物分泌的技术。 (4)酶工程(enzyme engineering)又称为酵技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性， 结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品：以及利用重组DNA 技术定向改变酶，进行的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的 固定化、酶反 应器等。 (5)蛋白质工程(protein engineering)是更「广义上的包括酶工程在内的蛋白质移饰梯作 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非自然蛋白质的技术。主要是 根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造 基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。 (6)发酵工程(f g eering)又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物 主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段，生产有用物质，或把微生物直接 用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育，发酵生产微生物，或植物细 胞的代谢产物，生产微生物菌体，最佳培养条件的优化组合等。 (7)干细胞工程(Stem cell engineering) 重点介绍基因工程与干细胞工程 二、基因工程的基本原理 作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。 为达到此目的，可从以下四个方面考虑。 (1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载 体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达 水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这 些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平 (3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞 中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理 (4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产 效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反 应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节，这里涉及的是生物化
能源和资源以及环境和健康等迫切需要解决的问题发挥重要的作用，并展现了极其诱人的前 景。生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程等。 （1）基因工程（gene engineering）又称基因操作（gene manipulation）、重组 DNA（recombinant DNA）。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因（DNA 分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导 入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和 功能。 （2）细胞工程（cell engineering）应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段， 按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖 细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、 染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微 生物工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。 （3）细胞分泌工程是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技 术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因 等措施，促进基因产物分泌的技术。 （4）酶工程（enzyme engineering）又称为酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性， 结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品；以及利用重组 DNA 技术定向改变酶，进行酶的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的 固定化、酶反应器等。 （5）蛋白质工程（protein engineering）是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作， 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非自然蛋白质的技术。主要是 根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造 基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。 （6）发酵工程（fermentation engineering）又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物， 主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段，生产有用物质，或把微生物直接 用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育，发酵生产微生物，或植物细 胞的代谢产物，生产微生物菌体，最佳培养条件的优化组合等。 （7）干细胞工程（Stem cell engineering） 重点介绍基因工程与干细胞工程 二、基因工程的基本原理 作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。 为达到此目的，可从以下四个方面考虑。 （1）利用载体 DNA 在受体细胞中独立于染色体 DNA 而自主复制的特性，将外源基因与载 体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达 水平。这里涉及到 DNA 分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。 （2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这 些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。 （3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等 mRNA 的翻译调控元件，强化受体细胞 中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理。 （4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产 效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反 应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节，这里涉及的是生物化
学工程学的基本理论体系 因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。 三、基因工程所需元件 (一)工只酶 基因工程中的许多工作都涉及到对DNA讲行切害割和重组，或对DNA讲行修饰或合成 这些工作都是通讨酶的作用来完成的。切割、合成、连接、修饰等各种工且酶都是必不可少 的。 1、限制 限制酶(restriction enzyme)是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类 酶能识别双链DNA内部特异位点并且裂解磷酸二脂键。 (1)限制酶的分类根据酶结构、作用及与DNA结合和裂解的特异性，将限制酶分为三 DNA。 县有限和D货物：这酒常在识别点下瑞0，p处切为 只别位点附近 制DNA 切 点很难预测。在基因克隆中，I型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶是DNA重组技 术中最重要的工具酶，它能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA,其切割位 点的序列可知、固定。通常所说的限制酶就是指这一类酶。 (2)限制路的命名 (3)限制酶的识别和切割位点通常是4~6碱基对，具有回文序列(palindrom)的DNA 片段，大多数酶是错位切制双链DNA,产生5'或3'粘性未端(stickyend)。 如EcoR I切割后产生5'粘性未端： (4)周功异源海 (5)同尾酶(isoaudamers) 2、修饰醇 基因工程中常用的工具酶有许多是对DNA和RNA分子未端进行剪切、补平、连接及化 学修饰的酶，常见的有以下几种： (1)DNA聚合酶I DNA聚合醇I是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量 为109kD。它能以DNA为模板，以4种脱氧核苷酸为底物以及Mg2的参与下，在引物的游 离3一0H上，形成3,5 -磷酸二酯键。该酶除有聚合酶活性外，尚有3'→5及5 3'核酸外切酶活性。由于它具有5”一3'核酸外切酶活性，当用缺口平移法((nick 标记DNA探针时，常用DNA聚合酶I。 用枯草杆茵蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为大小两个片段，大片段的分子量为76kD, 这个片段也称为Klenow片段(Klenow fragment)。它具有5'→3'聚合酶活性及3'→5' 外切酶活性，而失去了5'→3'外切酶活性。它具有的3一5'外切酶活性能保证DNA 复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。 Klenow片段的主要用途有：①补齐双链DNA的3'末端。②通过补齐3'端使3'未端标记 ③在cDNM克隆中，第二股链的合成。④DN序列分析。 (2)逆转录酶(reverse transcriptase)常用的逆转录酶有两种，禽类成骨细胞性白血病 病毒(AW)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(BLV)逆转录酶。逆转录酶以NA为模 板合成DNA,合成时需要4种脱氧核苷酸及引物，合成方向为5 →3延伸，无3→5 外切酶活性。 广泛用 以nRNA为模板合成cDN 构建 A文库 (3)T4DNA连接酶(T4DNA1 igase)T4DNA连接酶催化双链DNA一端3'-OH与另一双 链DNA的5'端磷酸根形成3'，5'一磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNM末端 连接起来
学工程学的基本理论体系。 因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。 三、基因工程所需元件 （一）工具酶 基因工程中的许多工作都涉及到对 DNA 进行切割和重组，或对 DNA 进行修饰或合成。 这些工作都是通过酶的作用来完成的。切割、合成、连接、修饰等各种工具酶都是必不可少 的。 1、限制酶 限制酶（restriction enzyme）是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类 酶能识别双链 DNA 内部特异位点并且裂解磷酸二脂键。 （1）限制酶的分类 根据酶结构、作用及与 DNA 结合和裂解的特异性，将限制酶分为三 型。Ⅰ型酶具有限制和 DNA 修饰作用，这种酶通常在识别位点下游 100～1000bp 处切割 DNA。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割 DNA，切割位 点很难预测。在基因克隆中，Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶是 DNA 重组技 术中最重要的工具酶，它能在 DNA 分子内部的特异位点识别和切割双链 DNA，其切割位 点的序列可知、固定。通常所说的限制酶就是指这一类酶。 （2）限制酶的命名 （3）限制酶的识别和切割位点 通常是 4～6 碱基对，具有回文序列（palindrom）的 DNA 片段，大多数酶是错位切割双链 DNA，产生 5＇或 3＇粘性未端（sticky end）。 如 EcoRⅠ切割后产生 5＇粘性未端： （4）同功异源酶 （5）同尾酶（isoaudamers） 2、修饰酶 基因工程中常用的工具酶有许多是对 DNA 和 RNA 分子未端进行剪切、补平、连接及化 学修饰的酶，常见的有以下几种： （1）DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅰ是从大肠杆菌中发现的第一个 DNA 聚合酶，分子量 为 109kD。它能以 DNA 为模板，以 4 种脱氧核苷酸为底物以及 Mg2+的参与下，在引物的游 离 3＇—OH 上，形成 3＇，5＇-磷酸二酯键。该酶除有聚合酶活性外，尚有 3＇→5＇及 5＇ →3＇核酸外切酶活性。由于它具有 5＇→3＇核酸外切酶活性，当用缺口平移法（nick translation） 标记 DNA 探针时，常用 DNA 聚合酶Ⅰ。 用枯草杆菌蛋白酶可将 DNA 聚合酶Ⅰ裂解为大小两个片段，大片段的分子量为 76kD， 这个片段也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。它具有 5＇→3＇聚合酶活性及 3＇→5＇ 外切酶活性，而失去了 5＇→3＇外切酶活性。它具有的 3＇→5＇外切酶活性能保证 DNA 复制的准确性，把 DNA 合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。 Klenow 片段的主要用途有：①补齐双链 DNA 的 3＇末端。②通过补齐 3＇端使 3＇末端标记。 ③在 cDNA 克隆中，第二股链的合成。④DNA 序列分析。 （2）逆转录酶（reverse transcriptase）常用的逆转录酶有两种，禽类成骨细胞性白血病 病毒（AMV）逆转录酶和 Moloney 小鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。逆转录酶以 RNA 为模 板合成 DNA，合成时需要 4 种脱氧核苷酸及引物，合成方向为 5＇→3＇延伸，无 3＇→5＇ 外切酶活性。广泛用于以 mRNA 为模板合成 cDNA，构建 cDNA 文库。 （3）T4DNA 连接酶（T4 DNA ligase） T4DNA 连接酶催化双链 DNA 一端 3＇-OH 与另一双 链 DNA 的 5＇端磷酸根形成 3＇，5＇-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的 DNA 末端 连接起来
(4)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)能去除DNA或NA5'瑞的磷酸根 制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 (5)末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase 简称末端 转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3'OH上，主要用于探针标记：或者在载体 和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 (6)Taq DNA聚合酶和其他耐热DNA聚合酶见PCR反应。 除此之外，还有T4多聚核苷酸激酶，RNA聚合酶，核酸酶等。 ( )载体 克隆载体：应用重组DNA技术克隆DNA片段时，通常采用大肠杆菌作为宿主细胞(hOg c©l)。所要克隆的目的DNA没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效 的方法将导入外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA 导入宿主细胞后，本身不能结宿主细胞的繁殖而自制，即没有自主复制能力，达不到使外源 DNA片段扩增的目的 如果要将外源DN 片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有 个能在该宿主细胞中进行自我复制和表达的载体(v©ctor)来携带，载体实际上也是DNA 外源DNA片段与载体在体外连接，构成DNA重组体，然后导入宿主细胞，使之进行扩增 或表达。以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体。 将常用克降载体中加入一些与表达调控有关的元件(DNA序列)，即成为表达载体，不 仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞中表达外源基因。 表达载 (expressing vec 是用来 表达（转录和翻译）外源基因的载 体。这类载体除具有克隆所具备的性质以外，还带有表达构件一 转录和翻译所必需的DNA 序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如大肠杆菌、分枝杆菌、放线菌、酵母、哺 乳动物细胞等，各有相应的表达载体。 四、因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部 分组成。前者主要在实验宽里进行，其单元操作过程如下： (I)从供体细胞中分离出基因组DNA,用限制性核酸内切酸酶分别将外源DNA(包括外 源基因成目的基因)和载体分子切开（简称切） (2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简 称接) (3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）： (4)短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简 称增)： 《5)篇洗和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程茵或细胞（简称拾） 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检 五、基因工程的发展历史 从基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同 生物米源的DNA分子的切制与连接、DNA拼接反应的检测方法以及重组DNA分子导入受 体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于20世纪0年代初发展起来的， 并迅速导致了第 个DNA体外重组实验的诞生 1.2.1基因工程的诞生 1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、A噬菌体基因以及大 肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人
（4）碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）能去除 DNA 或 RNA5＇端的磷酸根。 制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 （5）末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT） 简称末端 转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到 DNA 的 3＇-OH 上，主要用于探针标记；或者在载体 和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 （6）Taq DNA 聚合酶和其他耐热 DNA 聚合酶 见 PCR 反应。 除此之外，还有 T4 多聚核苷酸激酶，RNA 聚合酶，核酸酶等。 （二）载体 克隆载体：应用重组 DNA 技术克隆 DNA 片段时，通常采用大肠杆菌作为宿主细胞（host cell）。所要克隆的目的 DNA 没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效 的方法将导入外源 DNA 片段的细胞和没有导入外源 DNA 的细胞区分开来。此外，外源 DNA 导入宿主细胞后，本身不能随宿主细胞的繁殖而自制，即没有自主复制能力，达不到使外源 DNA 片段扩增的目的。如果要将外源 DNA 片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有 一个能在该宿主细胞中进行自我复制和表达的载体（vector）来携带，载体实际上也是 DNA。 外源 DNA 片段与载体在体外连接，构成 DNA 重组体，然后导入宿主细胞，使之进行扩增 或表达。以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、λ噬菌体、粘粒和 M13 噬菌体。 将常用克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA 序列），即成为表达载体，不 仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞中表达外源基因。 表达载体（expressing vector）：是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载 体。这类载体除具有克隆所具备的性质以外，还带有表达构件——转录和翻译所必需的 DNA 序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如大肠杆菌、分枝杆菌、放线菌、酵母、哺 乳动物细胞等，各有相应的表达载体。 四、因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部 分组成。前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组 DNA，用限制性核酸内切酸酶分别将外源 DNA（包括外 源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）； （2）用 DNA 连接酶将含有外源基因的 DNA 片段接到载体分子上，形成 DNA 重组分子（简 称接）； （3）借助于细胞转化手段将 DNA 重组分子导入受体细胞中（简称转）； （4）短时间培养转化细胞，以扩增 DNA 重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简 称增）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。 五、基因工程的发展历史 从基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同 生物来源的 DNA 分子的切割与连接、DNA 拼接反应的检测方法以及重组 DNA 分子导入受 体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于 20 世纪 70 年代初发展起来的， 并迅速导致了第一个 DNA 体外重组实验的诞生。 1.2.1 基因工程的诞生 1972 年美国 Berg 和 Jackson 等人将猿猴病毒基因组 SV40 DNA、λ噬菌体基因以及大 肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的 Cohen 和 Boyer 等人
在体外构建出含省四环素和结霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，移 重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宜告了基因工程的诞生。 )在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有 能使大肠杆菌具备其 他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能， 如光合作用和抗生素合成等 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的维 续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括Co本人在内的分子生物 学家们都相心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界制造出一个不而知的危险物种 1975年西欧几个国家签署公约 限制基因重组的实验规模 二年美国政府也制订了相应的法规。至今世界上仍有少数国家坚持对基因 且技术的应月 范围进行严格的限制。 然而，分子生物学家们毕竞不愿看到先讲的科学技术排送在自己手中。从192年到1976 年短短的四年里，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包 括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，同 时还建立了 套严格的DNA重组实验 计与操作规 范。众多安全可靠 关技 及巨大的潜在诱惑力，终于使DNA重组技术走出困境并迅速发展起来。 12.2基因工程的成熟 早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平 密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的牛理功能。197 年，日本的Tfahura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。 几个月后，美国的Uvch随即克隆表达了人的胰岛素基因。1978年 美国Genentech公司 开发出利用重组大肠杆菌合成2胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序 幕。 最近10年来又有数以百计的新型基因工程药物问世，另有400余种药物正处于研制开 发中。DNA组技术已溪渐取代经典的赏生物透弯有种程序，大大推讲了微生物种群的非 自然有益进化的进程 1.2.3基因工程的腾日 20世纪80年代以来，基因工程已开始朝若高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基 因治疗等方向发展。1982年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培有出具 白大鼠雄肆体魄的转基因小鼠及其子代。1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组雪质 粒转化植物细胞我 得成功 高等植物转基因技术问世。1990 年美国政府首次批准一项人体 基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进 行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。1991年，美国侣导在全球范围内实 施雄心勃勃的人类基因组计划，用15年时间斥资30亿美元，完成125000个人类基因的全 部测序工作。1994年底，一张覆盖整个基因组的人类遗传图谱己经完成，而高质量的物理 图谱也已覆盖了95%的基因组。1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利 如果借助于某种限制巧妙地避开论理道德方面的社会学问题，那么人类在实验室里复 制自身的尝试必将会产生无法估量的社会经济价值。 六、基因工程研究的意义 近半个世纪的分子生物学和分子遗传学研究结果表明，基因是控制一切生命运动的物质 形式。基因工程 本质是按照人们的设计蓝图 将生物体内控制性状的基因进行优化重组 并使其稳定遗传和表达。这一技术在超越生物王国种属界限的同时，简化了生物物种的进化 程序，大大加快了生物物种的进化速度，最终卓有成效地将人类生活品质提高到一个崭新的 水平。因此，基因工程诞生的意义毫不逊色于有史以来的任何一次技术革命
在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该 重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。 正如 Cohen 在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其 他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合作用和抗生素合成等。 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的继 续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括 Cohen 本人在内的分子生物 学家们都担心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界创造出一个不可预知的危险物种， 致使人类遭受灭顶之灾。于是，1975 年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模。 第二年美国政府也制订了相应的法规。至今世界上仍有少数国家坚持对基因重组技术的应用 范围进行严格的限制。 然而，分子生物学家们毕竟不愿看到先进的科学技术葬送在自己手中。从 1972 年到 1976 年短短的四年里，人们对 DNA 重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包 括噬菌体 DNA 载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，同 时还建立了一套严格的 DNA 重组实验室设计与操作规范。众多安全可靠的相关技术支撑以 及巨大的潜在诱惑力，终于使 DNA 重组技术走出困境并迅速发展起来。 1.2.2 基因工程的成熟 早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平 密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的生理功能。1977 年，日本的 Tfahura 及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。 几个月后，美国的 Ullvich 随即克隆表达了人的胰岛素基因。1978 年，美国 Genentech 公司 开发出利用重组大肠杆菌合成 2 胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序 幕。 最近 10 年来又有数以百计的新型基因工程药物问世，另有 400 余种药物正处于研制开 发中。DNA 重组技术已逐渐取代经典的微生物诱变育种程序，大大推进了微生物种群的非 自然有益进化的进程。 1.2.3 基因工程的腾飞 20 世纪 80 年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基 因治疗等方向发展。1982 年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培育出具 有大鼠雄健体魄的转基因小鼠及其子代。1983 年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组 Ti 质 粒转化植物细胞获得成功，高等植物转基因技术问世。1990 年美国政府首次批准一项人体 基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进 行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。1991 年，美国倡导在全球范围内实 施雄心勃勃的人类基因组计划，用 15 年时间斥资 30 亿美元，完成 125 000 个人类基因的全 部测序工作。1994 年底，一张覆盖整个基因组的人类遗传图谱已经完成，而高质量的物理 图谱也已覆盖了 95%的基因组。1997 年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利” 绵羊，如果借助于某种限制巧妙地避开论理道德方面的社会学问题，那么人类在实验室里复 制自身的尝试必将会产生无法估量的社会经济价值。 六、基因工程研究的意义 近半个世纪的分子生物学和分子遗传学研究结果表明，基因是控制一切生命运动的物质 形式。基因工程的本质是按照人们的设计蓝图，将生物体内控制性状的基因进行优化重组， 并使其稳定遗传和表达。这一技术在超越生物王国种属界限的同时，简化了生物物种的进化 程序，大大加快了生物物种的进化速度，最终卓有成效地将人类生活品质提高到一个崭新的 水平。因此，基因工程诞生的意义毫不逊色于有史以来的任何一次技术革命