第七章核酸的分子杂交 第一节核酸分子杂交的概念 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件 下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异 源双链分子称为杂交分子。 第二节核酸分子杂交的的用途 核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。用途： I、是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具： 2、在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或cD八NA探针进行菌落杂 交，可从DA文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某 一重组体 3、用克隆化的DNA片段作探针进行Southern杂交，可确定基因组DNA上特定区域的核苷 酸同源顺序： 4、用SI核酸酶或RNA醇消化DNA/RNA或者RNA/RNA杂交体是分析基因转录或RNA 加工的重要方法： 5、对某一己知基因或己克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位： 6、可用于遗传病的基因诊断，用于限制性片段长度多态性作疾病的相关分析，基因连锁分 析，法医学上的性别分析和亲子鉴定。 7、在人类学研究中，HLA分型等方面也有应用价值。 第三节核酸分子杂交的原理 核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的 温度及离子强度等)碱基互补配对结合，重新形成双链：在这一过程中，核酸分子经历了变 性和复性的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和 已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针(probe),探针通常用于进行核素或 非核素示踪标记。 探针的意义：要检测某一样品或基因组DNA中特定的DNA顺序或基因片段，首先必须 获得相应的探针，即已知顺序的DNA或RNA片段，并使它带上可检测到的示踪标记。 分子杂交的形式： (1)固一液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸固定在 适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则， 两条单链的同源顺序通过氢健互相结合 ,形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待 检测样品中相应顺序的存在与否及分子量大小。 (2)液相杂交有时也将待测核酸和己知核酸同时放在液体中进行杂交反应。 两种杂交形式的基木原理都是一样的。 第四节核酸分子杂交的的过程 -DNA的变性与复性
第七章 核酸的分子杂交 第一节 核酸分子杂交的概念 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件 下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异 源双链分子称为杂交分子。 第二节 核酸分子杂交的的用途 核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。用途： 1、是定性或定量检测特异 DNA 或 RNA 序列片段的有力工具； 2、在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或 cDNA 探针进行菌落杂 交，可从 cDNA 文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体； 3、用克隆化的 DNA 片段作探针进行 Southern 杂交，可确定基因组 DNA 上特定区域的核苷 酸同源顺序； 4、用 S1 核酸酶或 RNA 酶消化 DNA/RNA 或者 RNA/RNA 杂交体是分析基因转录或 RNA 加工的重要方法； 5、对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位； 6、可用于遗传病的基因诊断，用于限制性片段长度多态性作疾病的相关分析，基因连锁分 析，法医学上的性别分析和亲子鉴定。 7、在人类学研究中，HLA 分型等方面也有应用价值。 第三节 核酸分子杂交的原理 核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的 温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变 性和复性的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和 已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针（probe），探针通常用于进行核素或 非核素示踪标记。 探针的意义：要检测某一样品或基因组 DNA 中特定的 DNA 顺序或基因片段，首先必须 获得相应的探针，即已知顺序的 DNA 或 RNA 片段，并使它带上可检测到的示踪标记。 分子杂交的形式： ⑴固—液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸固定在 适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则， 两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待 检测样品中相应顺序的存在与否及分子量大小。 ⑵液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放在液体中进行杂交反应。 两种杂交形式的基本原理都是一样的。 第四节 核酸分子杂交的的过程 —DNA 的变性与复性
1、变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸碱或紫外线照射，可以导致两条NA 链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键〔如磷酸二酯键、糖苷键等)则不受影响， 称为DNA变性 denaturation 导致DNA变性的常用方法有三种 (1)热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打 开。变性的情况： a.T(T0PC.DNA几平不变性 b.70℃<T<90( e.T>9C. d.T>1O0PC,DNA双硅分离 所以，一般核酸变性的温度都选在90一100P℃之间。 (2)酸碱变性：当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链 核酸分子。在分子杂交中，最常用的核酸变性方法是碱变性。因通常需要的核酸的载体如凝 胶或膜对热都不稳 (3)化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲醛等时，两条链之 何的氢健可以断裂而形成单链核酸分子。 除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的因素是DNA分子中的 GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而AT含量高的DNA容易变性。另外，环状DNA 比线性DNA难于变性 2、复性 DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分子在变性条件除去后重新按碱基互 补原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称作DNA复性(DNA renaturation)。 如果是异源双麟分子的结合则称为杂交」 相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如 DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等 第五节影响核酸分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。 这一过程受到诸多因素的影响 1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快：分子量越大，复性速度越慢。 一般情况下：探针浓度为0.1~0.5μg:长度为50~300bp 2、温度：适宜温度为比Tm值低25℃. Tm一双链DNA变性一半所需要的温度(DNA的溶解温度，melting temperature,Tm) 3、离子强度： 必须维持较高的杂交反应液和洗膜液的盐浓度。 4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，从而使得：(1)在低温下探针更 稳定：(2)能更好地保留非共价结合的核酸。一般是：50%甲酰胺35~42℃。 5、核酸分子的复杂性：不同顺序的总长度(DNA的碱基数)。 1、非特异性杂交反应：须在杂交前封闭非特异性杂交位点，以减少其对探针的非特异性 吸附作用 第六节核酸分子杂交的基本方法 根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：
1、变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸碱或紫外线照射，可以导致两条 DNA 链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响， 称为 DNA 变性（DNA denaturation）。 导致 DNA 变性的常用方法有三种： （1）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打 开。变性的情况： a. T<700C，DNA 几乎不变性； b. 700C <T<900C，DNA 部分变性； c. T>900C，DNA 变性使双链打开，成为单链分子； d .T>100 0C，DNA 双链分离。 所以，一般核酸变性的温度都选在 90～1000C 之间。 （2）酸碱变性：当核酸溶液的 pH 低于 3 或高于 10 时，核酸的双链可以完全打开成为单链 核酸分子。在分子杂交中，最常用的核酸变性方法是碱变性。因通常需要的核酸的载体如凝 胶或膜对热都不稳定。 （3）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲醛等时，两条链之 间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。 除物理、化学因素外，DNA 分子的组成也影响变性。最主要的因素是 DNA 分子中的 GC 含量，GC 含量高的 DNA 不易变性，而 AT 含量高的 DNA 容易变性。另外,环状 DNA 比线性 DNA 难于变性 2、复性 DNA 的变性是可逆的，即两条互补的单链 DNA 分子在变性条件除去后重新按碱基互 补原则以氢键相连形成双链 DNA 分子，这一过程称作 DNA 复性（DNA renaturation）。 如果是异源双链分子的结合则称为杂交。 相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如 DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA 或人工合成的寡核苷酸片段与 DNA、RNA 等。 第五节 影响核酸分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。 这一过程受到诸多因素的影响。 1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子量越大，复性速度越慢。 一般情况下：探针浓度为 0.1～0.5μg；长度为 50～300 bp。 2、温度：适宜温度为比 Tm 值低 250 C。 Tm—双链 DNA 变性一半所需要的温度(DNA 的溶解温度，melting temperature,Tm) 3、离子强度： 必须维持较高的杂交反应液和洗膜液的盐浓度。 4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的 Tm 值，从而使得：（1）在低温下探针更 稳定；（2）能更好地保留非共价结合的核酸。一般是：50%甲酰胺 35～420C。 5、核酸分子的复杂性：不同顺序的总长度（DNA 的碱基数）。 1、 非特异性杂交反应： 须在杂交前封闭非特异性杂交位点，以减少其对探针的非特异性 吸附作用。 第六节 核酸分子杂交的基本方法 根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：
(一)Southern印迹杂交 Southern印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合 定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。基本步骤： 1.待测核酸样品的制备 (I)、制备待测DNA:从样本的细胞或组织中制备DNA (2)、DNA的限制酶消化：将DNA切割成大小不同的片段 2.待测DNA样品的电泳分离： 将DNA样品在O.8~1.0%琼脂糖凝胶中电泳，以对DNA片段进行分离（琼脂糖凝 是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，DNA因其分子大小而在琼脂糖凝胶中的 泳动速度不同达到分离)。 3.凝胶中核酸的变性：对凝胶中的DNA进行碱变性，使其形成较短的单链片段。 4.Southern转膜：将凝胶中的DNA片段转移到醋酸纤维膜(NC)等固相支持物上。各个 DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹(b1ot) Southern转膜的方法 (1)毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。 (2)电转印法：通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到滤膜上。 (3)真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同 5.探针的制备 用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针、标记。 6.Southern杂交 (I)预杂交封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后的膜在预杂交液（不含探针 的杂交液)46小时 (2)杂交（讨有 7.杂交结果的检 (1)放射线标记 一线感光胶片，显出黑色杂交带： (2)非放射线标记 直接显出杂交带。 8.Southern印迹杂交在医学中的应用 S0u小hern印迹杂交技术已右20余年的历史，在核酸的结构和功能研究中作出讨时重要员 献。如：发现成熟B细胞中免疫球蛋白基因重排现象：进行克隆基因的酶切图谱分析：特定 基因的定性和定量 :DNA多态性(RFLP,RAPD,AFLP等)分析 (二)Northern印迹杂交 Northern印迹杂交是指将待测RW样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记 的核酸探针进行固一液相杂交，以检测RNA(主要是mRNA)的方法。其基本原理和基本 过程与Southern印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。 、靶核酸 RNA 2、RNA电泳 在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单线性状态） 3、转膜 一不需要再进行变性和中和，直接用毛细管虹吸法等转移。 (三)斑点及狭缝印迹杂交 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及 其表法的定性及定研究 称为斑点印迹(do b1o)。如印迹是线状则为缝印迹。特点： 简单、快速：但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定的假阳性 (四)原位杂交 核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与 细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交(in situ hybridization)
（一）Southern 印迹杂交 Southern 印迹杂交是指 DNA 与 DNA 的杂交，将电泳分离的待测 DNA 片段转印并结合 到一定的固相支持物上，然后用标记的 DNA 探针检测待测 DNA 的一种方法。基本步骤： 1.待测核酸样品的制备 （1）、制备待测 DNA：从样本的细胞或组织中制备 DNA （2）、DNA 的限制酶消化：将 DNA 切割成大小不同的片段 2.待测 DNA 样品的电泳分离： 将 DNA 样品在 0.8～1.0%琼脂糖凝胶中电泳，以对 DNA 片段进行分离（琼脂糖凝胶 是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，DNA 因其分子大小而在琼脂糖凝胶中的 泳动速度不同达到分离）。 3.凝胶中核酸的变性：对凝胶中的 DNA 进行碱变性，使其形成较短的单链片段。 4.Southern 转膜：将凝胶中的 DNA 片段转移到硝酸纤维膜（NC）等固相支持物上。各个 DNA 片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹（blot）。 Southern 转膜的方法 （1）毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA 转移到固相 支持物上。 （2）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的 DNA 转移到滤膜上。 （3）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。 5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针、标记。 6. Southern 杂交 （1）预杂交 封闭膜上所有能与 DNA 结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针 的杂交液）4～6 小时 （2）杂交（过夜） 7.杂交结果的检测 （1） 放射线标记——线感光胶片，显出黑色杂交带； （2） 非放射线标记——直接显出杂交带。 8.Southern 印迹杂交在医学中的应用 Southern 印迹杂交技术已有 20 余年的历史，在核酸的结构和功能研究中作出过重要贡 献。如：发现成熟 B 细胞中免疫球蛋白基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定 基因的定性和定量；DNA 多态性(RFLP,RAPD,AFLP 等)分析. （二）Northern 印迹杂交 Northern 印迹杂交是指将待测 RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记 的核酸探针进行固—液相杂交，以检测 RNA（主要是 mRNA）的方法。其基本原理和基本 过程与 Southern 印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。 1、靶核酸——RNA 2、RNA 电泳——在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单线性状态） 3、转膜——不需要再进行变性和中和，直接用毛细管虹吸法等转移。 （三）斑点及狭缝印迹杂交 将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及 其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹(dot blot)。如印迹是线状则为狭缝印迹。特点： 简单、快速；但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定的假阳性。 （四）原位杂交 核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与 细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交（in situ hybridization）
这是一种标记DNA与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。 特点：(1)不受组织成分的影响：(2)灵敏度高：(3)可完整保持细胞或组织形态，准确反 映组织细胞的相互关系及功能 (4)可检测多个探针。 核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤 1、组织或细胞的固定 2、组织细胞杂交前的预处理（预杂交） 3、探针的选择和标记 重点介绍荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH) (五)液相杂交 概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸 分子在液体中配对形成杂交分子。 种类 I、RNA酶保护分析法(RNase protection assay,RPA) 用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。 (I)制备待测RNA (2)RNA探针的标记 (3)杂交 (4)除去单链RN (5)电泳分析 2、核酸摩S1保护分析法(nuclease S1 protection assay) 用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。 其原理与NA酶保护分析法类似。 第七节探针的标记 一、针的种类 cDNA探针：逆转录→cDNA一克隆载体一扩增重组质粒一提取质粒一消化重组质 粒一切割cDNA片段一分离纯化一cDNA探针 cDNA探针应用最广泛 2、基因组DNA探针：从基因组文库→筛选特定基因（或基因片段）→克隆一扩增→ 纯化·切取片段→分离纯化→探针 3、核参探针. 一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸以上） 4、RNA探针：以RNA作为探针（基因克隆和体外转录获得 一、标记物 1、核素标记物 2、非核素标记物 (1)半抗原 生物素(biotin))和地高辛(digoxin,digacin,DIG) (2)配体：生物素既是半抗原，又是亲和素(avidin,抗生物素蛋白)，故可用生物素-亲和 素反应进行杂交信号检测 (3)荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)
这是一种标记 DNA 与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。 特点：（1）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（3）可完整保持细胞或组织形态，准确反 映组织细胞的相互关系及功能；（4）可检测多个探针。 核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。 1、组织或细胞的固定 2、组织细胞杂交前的预处理（预杂交） 3、探针的选择和标记 4、杂交 5、杂交结果检测 重点介绍荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH） （五）液相杂交 概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸 分子在液体中配对形成杂交分子。 种类： 1、RNA 酶保护分析法(RNase protection assay,RPA) 用于 mRNA 定量、mRNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。 （1）制备待测 RNA （2）RNA 探针的标记 （3）杂交 （4）除去单链 RNA （5）电泳分析 2、核酸酶 S1 保护分析法(nuclease S1 protection assay) 用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。 其原理与 RNA 酶保护分析法类似。 第七节 探针的标记 一、针的种类 1、cDNA 探针：逆转录 →cDNA→ 克隆载体→扩增重组质粒 → 提取质粒 → 消化重组质 粒 →切割 cDNA 片段 → 分离纯化 → cDNA 探针 cDNA 探针应用最广泛 2、基因组 DNA 探针：从基因组文库 → 筛选特定基因（或基因片段）→ 克隆 → 扩增 → 纯化 → 切取片段 →分离纯化 → 探针 3、寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸以上） 4、RNA 探针：以 RNA 作为探针 （基因克隆和体外转录获得） 二、标记物 1、核素标记物 2、非核素标记物 （1）半抗原：生物素(biotin)和地高辛(digoxin, digacin, DIG) （2）配体：生物素既是半抗原，又是亲和素(avidin，抗生物素蛋白)，故可用生物素-亲和 素反应进行杂交信号检测 （3）荧光素：异硫氰酸荧光素( FITC)
(4)化学发光探针 三、标记方 1、缺口平移法(nick translation) 2、随机引物法(randon primer) 3、PCR标记法 4、未端标记法 四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法 2、Sephadex G-50柱层析法 3、柱离心法
（4）化学发光探针 三、标记方法 1、缺口平移法(nick translation) 2、随机引物法(randon primer) 3、PCR 标记法 4、末端标记法 四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法 2、Sephadex G-50 柱层析法 3、柱离心法