《病理生理学》课程教学资源（实验指导）急性肾功能衰竭及肾功对药物作用的影响.doc

急性肾功能衰竭及肾功对药物作用的影响肾脏是人体重要器官之一，对调节和维持人体内环境的稳定有重要作用。当各种病因引起肾脏的泌尿功能在短期内急剧下降，机体内环境将会发生严重紊乱，临床表现有尿量和尿成份的变化、氮质血症、高钾血症和代谢性酸中毒。其发病机制主要与肾血液灌流减少、肾小管阻塞、肾小管原尿返漏等因素有关。【实验目的】复制中毒性肾功能衰竭的动物模型。观察急性肾功能衰竭时家免出现的各种功能代谢变化，进一步探讨急性肾功能衰竭发生的机理。【实验原理】用升汞引起急性肾小管坏死（ATN）复制中毒性肾病，并观察少尿期主要机能代谢变化。【实验对象】家兔（体重在2-2.5kg）【器材、药品】1%HgC12、0.9%NaC1溶液、1%普鲁卡因、0.2%肝素钠溶液、肌酐标准应用液、苦味酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、3%焦锑酸钾溶液、无水乙醇、氢氧化钙、钠标准应用液、pH12.0磷酸盐一氢氧化钠缓冲液、724型分光光度计、离心机、恒温水筒、5ml离心管、5ml注射器、0.5ml、2ml、5ml刻度吸管、手术器械、火焰光度计、血气分析仪。【方法步骤与观察项目】本实验以一般状态、尿量、尿蛋白、血浆肌酐、尿肌酐、内生肌酐清除率、血浆钠、尿钠、血浆钾、滤过钠排泄分数、酚红排泄率、肾形态学观察为观察指标。（一）复制模型：在实验前24小时取两只家免兔称重后，一只肌肉（或皮下）注射1%HgC12（1.2m1/kg）造成急性肾功能衰竭，另一只在相同部位注射等量的生理盐水作为正常对照。（二）取上述两只家兔分别称重固定于兔台上，耳缘静脉注射5%葡萄糖溶液（15ml/kg），以保证有足够的尿量。（三）颈部剪毛、局麻、作颈动脉插管，取血置于盛有肝素的离心管内，离心(2000rpm，15min）后取血浆以备测定血中肌酐钠浓度。（四）腹部剪毛、局麻，在耻骨联合上1.5cm处作腹正中切口，分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，暴露膀胱，抽取膀胱中的尿液以备作尿肌酐、尿钠浓度测定，分离两侧输尿管，作输尿管插管，收集1h尿液，换算成每分钟排尿量。（五）观察实验组及对照组家免的一般状态、呼吸、尿量等。(六)P.S.P试验1.从家免耳缘静脉内准确快速注入酚红溶液6mg/ml，立即记时。2.用50ml注射器抽取生理盐水30ml及20%葡萄糖20ml，由耳缘静脉注入3.分别于注射酚红后30分钟、1小时后收集尿量。4.将每次收集的尿量放入500ml量筒内，加10%Na0H5ml，再加水至500ml，搅拌均匀后，从中取10m1置于标准管内径相等的试管中与标准管比色，得出不同时间内酚红排除率。（七）尿蛋白定性试验将膀胱中收集的尿液取5ml置于试管中在酒精灯上加热至沸腾，待尿变混浊后加10%醋酸3-5滴，如混浊不退（或加热混浊仍不退）为蛋白定性试验阳性，按其混浊程度与下面标准判定结果，如加醋酸后尿变清，是尿中无机盐所致。"_"表示尿液清晰不显混浊“+”尿液出现轻度白色混浊，呈白雾状（含蛋白质约0.01-0.05克%）

急性肾功能衰竭及肾功对药物作用的影响肾脏是人体重要器官之一，对调节和维持人体内环境的稳定有重要作用。当各种病因引起肾脏的泌尿功能在短期内急剧下降，机体内环境将会发生严重紊乱，临床表现有尿量和尿成份的变化、氮质血症、高钾血症和代谢性酸中毒。其发病机制主要与肾血液灌流减少、肾小管阻塞、肾小管原尿返漏等因素有关。【实验目的】复制中毒性肾功能衰竭的动物模型。观察急性肾功能衰竭时家兔出现的各种功能代谢变化，进一步探讨急性肾功能衰竭发生的机理。【实验原理】用升汞引起急性肾小管坏死（ATN）复制中毒性肾病，并观察少尿期主要机能代谢变化。【实验对象】家兔(体重在 2-2.5kg) 【器材、药品】 1%HgCl2、0.9%NaCl 溶液、1%普鲁卡因、0.2%肝素钠溶液、肌酐标准应用液、苦味酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、3%焦锑酸钾溶液、无水乙醇、氢氧化钙、钠标准应用液、pH 12.0 磷酸盐－氢氧化钠缓冲液、724 型分光光度计、离心机、恒温水筒、5ml 离心管、5ml 注射器、0.5ml、2ml、5ml•刻度吸管、手术器械、火焰光度计、血气分析仪。【方法步骤与观察项目】本实验以一般状态、尿量、尿蛋白、血浆肌酐、尿肌酐、内生肌酐清除率、血浆钠、尿钠、血浆钾、滤过钠排泄分数、酚红排泄率、肾形态学观察为观察指标。 (一)复制模型：在实验前•24•小时取两只家兔称重后，一只肌肉(或皮下)注射 1%HgCl2(1.2ml╱kg)造成急性肾功能衰竭，另一只在相同部位注射等量的生理盐水作为正常对照。 (二)取上述两只家兔分别称重固定于兔台上，耳缘静脉注射 5%葡萄糖溶液（15ml/kg），以保证有足够的尿量。 (三)颈部剪毛、局麻、作颈动脉插管，取血置于盛有肝素的离心管内，离心(2000rpm， 15min)后取血浆以备测定血中肌酐钠浓度。 (四)腹部剪毛、局麻，在耻骨联合上 1.5cm 处作腹正中切口，分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，暴露膀胱，抽取膀胱中的尿液以备作尿肌酐、尿钠浓度测定，分离两侧输尿管，作输尿管插管，收集 1h 尿液，换算成每分钟排尿量。 (五)观察实验组及对照组家兔的一般状态、呼吸、尿量等。 (六) P.S.P 试验 1.从家兔耳缘静脉内准确快速注入酚红溶液 6mg/ml，立即记时。 2.用 50ml 注射器抽取生理盐水 30ml 及 20%葡萄糖 20ml，由耳缘静脉注入。 3.分别于注射酚红后 30 分钟、1 小时后收集尿量。 4.将每次收集的尿量放入 500ml 量筒内，加 10%NaOH5ml，再加水至 500ml，搅拌均匀后，从中取 10ml 置于标准管内径相等的试管中与标准管比色，得出不同时间内酚红排除率。 (七)尿蛋白定性试验将膀胱中收集的尿液取 5ml 置于试管中在酒精灯上加热至沸腾，待尿变混浊后加 10%• 醋酸 3-5 滴，如混浊不退(或加热混浊仍不退)为蛋白定性试验阳性，按其混浊程度与下面标准判定结果，如加醋酸后尿变清，是尿中无机盐所致。 “－” 表示尿液清晰不显混浊 “＋” 尿液出现轻度白色混浊，呈白雾状(含蛋白质约 0.01-0.05 克%)

“＋＋” 尿液呈颗粒混浊(含蛋白质约 0.05-0.2 克%) “＋＋＋” 尿液呈絮状混浊(含蛋白质约 0.2-0.5 克%) “＋＋＋＋” 尿液呈块状混浊(含蛋白质>0.5 克%) (八)应用焦锑酸钾比浊法按下表的操作测定血清和尿钠含量。取膀胱中尿液 5ml，移入含氢氧化钙的试管中，用玻璃棒搅拌混匀，放置 15min 后离心 (2000rpm，5min)，吸取上清尿液(已除去磷酸盐类)至另一试管供作尿钠测定。钠测定操作步骤 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 标准管(ml) 测定管(ml) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 血清或尿滤液 - 0.2 钠标准应用液 0.2 - 无水乙醇 1.8 1.8 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 混和测定管离心(2000rpm，3min)•后吸取上清液，标准管直接吸取，分别移入另一试管。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 上清液 3%焦锑酸钾溶液混合、静置 5min 后用 520nm 波长，以蒸馏水校正光密度至零点进行比浊，记录各管光密度读数。计算：测定管光密度 ×140＝钠 mmol/l 标准管光密度 (九)按下表苦味酸沉淀蛋白的操作测定血清和尿肌酐含量。取膀胱中尿液 1ml，用蒸馏水作 1：100 稀释，以备测定尿中肌酐含量。肌酐测定操作步骤 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 标准管(ml) 测定管(ml) 空白管(ml) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 血清或 1：50 稀释尿 - 0.6 - 肌酐标准应用液 0.6 - - 蒸馏水 - - 0.6 50mmol/L 苦味酸 2.4 2.4 2.4 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 充分混匀 3min 后离心(2000rpm，10min)测定管，将上述三种试管中的上清液分别直接倾入另一试管内 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ PH12.0 磷酸盐－氢氧化钠缓冲液 0.6 0.6 0.6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

充分混合置37℃水箱中25min后取出室温冷却20min后，以波长525nm蒸馏水调零，比色记录各管光密度读数计算：测定管光密度一空白管光密度×2=肌酐mg/dl标准管光密度一空白管光密度尿中肌酐含量内生肌酐清除率：尿量（ml/min）=ml/min血中肌酐含量肌酐mg%×88.402=μmol/L（十）将上述测定的血清及尿的钠和肌酐和肌酐含量，按下列公式计算FEs。尿（Na）/血（Na*)FENa=X100尿（肌酐）/血（肌酐）（十一）应用火焰光度分析法按下述的操作测定血钾含量（或参见实验四十七高钾血症)1.血清的稀释：取血清0.1ml置于150×15m试管内，加重蒸馏水9.9ml，充分混匀。2.安装调试好仪器，将钾滤色片置于光路中，将样液吸入管放入钾标准液内，待火焰呈黄色后，开启快门，移动光栅，使检流计读数控制在80-100之间，作为钾标准读数，关闭快门。3.用重蒸馏水喷雾洗涤至火焰恢复到空白时所呈的蓝紫色。4.将样液吸入管放入稀释血清（1/100)中，待火焰呈黄色后，开启快门，记录检流计上的读数（钾样读数）关闭快门，依上法用重蒸水喷雾洗涤至火焰恢复到蓝紫色。计算：钾测定读数钾测定读数×4=mmol/LX0.04X100=钾标准读数钾标准读数（十二）形态学观察1.处死动物，取出两侧肾脏，沿肾之凸面中部作一水平切面，深达肾孟，注意肾包膜情况，切面的色泽、皮质与髓质分界是否清楚等，并与对照组免肾作比较。2.组织切片示教：于显微镜下观察皮质肾小管上皮有无明显的变性坏死、脱落，管腔内有无蛋白、红细胞和管型存在。【注意事项】（一）试管吸管等器材要求清洁。血清、尿液标本和标准液等试剂量必须准确，所有操作均应按生化要求严格进行。（二）于膀胱壁穿刺抽取尿液时，应于无血管处部位穿入，避免出血以致影响实验结果。（三）吸取酚红液一定要注意量的准确。（四）做尿蛋白定性试验加热时谨防管内尿液喷出伤人。（五）凡FE>2表明急性肾功能衰竭，FE<1为功能性急性肾衰，正常动物FE>I或<2。附：（一）3%焦锑酸钾溶液：称取焦锑酸钾（KzHzSb20·4H0)15g，加蒸馏水350ml和10%K0H

充分混合置 37℃水箱中 25min 后取出室温冷却 20min 后，以波长 525nm•蒸馏水调零，比色记录各管光密度读数计算：测定管光密度－空白管光密度 ×2＝肌酐 mg╱dl 标准管光密度－空白管光密度尿中肌酐含量内生肌酐清除率：尿量(ml╱min) =ml╱min 血中肌酐含量肌酐 mg%×88.402=μmol╱L (十)将上述测定的血清及尿的钠和肌酐和肌酐含量，按下列公式计算 FENa 尿〔Na+〕╱血〔Na+〕 FENa＝ ×100 尿〔肌酐〕╱血〔肌酐〕 (十一) 应用火焰光度分析法按下述的操作测定血钾含量(或参见实验四十七高钾血症) 1. 血清的稀释：取血清 0.1ml 置于 150×15mm 试管内，加重蒸馏水 9.9ml，充分混匀。 2. 安装调试好仪器，将钾滤色片置于光路中，将样液吸入管放入钾标准液内，待火焰呈黄色后，开启快门，移动光栅，使检流计读数控制在 80-100 之间，作为钾标准读数，关闭快门。 3. 用重蒸馏水喷雾洗涤至火焰恢复到空白时所呈的蓝紫色。 4. 将样液吸入管放入稀释血清(1/100)中，待火焰呈黄色后，开启快门，记录检流计上的读数(钾样读数)关闭快门，依上法用重蒸水喷雾洗涤至火焰恢复到蓝紫色。计算：钾测定读数钾测定读数 ×0.04×100＝ ×4＝mmol╱L 钾标准读数钾标准读数 (十二) 形态学观察 1.处死动物，取出两侧肾脏，沿肾之凸面中部作一水平切面，深达肾盂，注意肾包膜情况，切面的色泽、皮质与髓质分界是否清楚等，并与对照组兔肾作比较。 2.组织切片示教：于显微镜下观察皮质肾小管上皮有无明显的变性坏死、脱落，管腔内有无蛋白、红细胞和管型存在。【注意事项】 (一)试管吸管等器材要求清洁。血清、尿液标本和标准液等试剂量必须准确，所有操作均应按生化要求严格进行。 (二)于膀胱壁穿刺抽取尿液时，应于无血管处部位穿入，避免出血以致影响实验结果。 (三)吸取酚红液一定要注意量的准确。 (四)做尿蛋白定性试验加热时谨防管内尿液喷出伤人。 (五)凡 FENa>2 表明急性肾功能衰竭，FENa<1 为功能性急性肾衰，正常动物 FENa>1 或<2。附： (一) 3%焦锑酸钾溶液：称取焦锑酸钾(K2H2Sb2O7·4H2O)15g，加蒸馏水 350ml 和 10%KOH