第四章基因治疗 技术与方法 基因治疗技术与方法 1基因转移 将基因转移入相应的靶细胞中是 基因治疗的前提。外源基因是能被转移 入生殖细胞或体细胞的。生殖细胞基因 转移导致基因型的改变,这种改变能代 代相传,所以目前对此有很大的伦理学 上的问题。体细胞基因转移则仅引起个 体的遗传学改变,不涉及后裔 体细胞基因转移 实施体细胞基因转移有两种方法 vⅳvo和 eX VIvO,均已在体细胞基因疗 法中应用过。 Ex vivo法是从病人处收 集细胞,将这些细胞在体外培养并导入 重组基因,然后将这些在遗传上加工的 细胞作为自体移植物重新植回病人体 内。 In vivo法是将重组基因直接送进活 体内各种体细胞中。一般说,基因治疗 的 ex vIvo基因转移可能要比 In vivo基 因转移的许多方法危险性更高些。目前 已经有许多种技术可将基因转移入真 核细胞中,绝大多数仅能用于体细胞基 因疗法 在基因治疗中迄今所应用的基因 转移方法可分为两大类:病毒方法和非 病毒方法。体细胞基因转移的理想方法 是将一定量的任何DNA能以100%的 效率导入任何类型的靶细胞中。此转基 因( transgene)必须或是整合在染色体 中,或是成为稳定的附加体( episome)
第四章 基因治疗 技术与方法 基因治疗技术与方法 1 基因转移 将基因转移入相应的靶细胞中是 基因治疗的前提。外源基因是能被转移 入生殖细胞或体细胞的。生殖细胞基因 转移导致基因型的改变，这种改变能代 代相传，所以目前对此有很大的伦理学 上的问题。体细胞基因转移则仅引起个 体的遗传学改变，不涉及后裔。 体细胞基因转移 实施体细胞基因转移有两种方法： in vivo 和 ex vivo，均已在体细胞基因疗 法中应用过。Ex vivo 法是从病人处收 集细胞，将这些细胞在体外培养并导入 重组基因，然后将这些在遗传上加工的 细胞作为自体移植物重新植回病人体 内。In vivo 法是将重组基因直接送进活 体内各种体细胞中。一般说，基因治疗 的 ex vivo 基因转移可能要比 In vivo 基 因转移的许多方法危险性更高些。目前 已经有许多种技术可将基因转移入真 核细胞中，绝大多数仅能用于体细胞基 因疗法。 在基因治疗中迄今所应用的基因 转移方法可分为两大类：病毒方法和非 病毒方法。体细胞基因转移的理想方法 是将一定量的任何 DNA 能以 100%的 效率导入任何类型的靶细胞中。此转基 因（transgene）必须或是整合在染色体 中，或是成为稳定的附加体（episome）
存在于该被遗传修饰的细胞后裔中,并 且还要在该靶细胞中长时期有效表达 1.1基因转移的非病毒方法 虽然非病毒介导的基因转移效率 低且为瞬时表达,但也相对比较安全 在美国及欧洲一些国家己将此方法用 于临床。先将其发展的主要方法分述如 直接注射法 Biolistic gene gun Tissue plasmid DNA 直接注射法含有 DNA的溶液(或 DNA沉淀物)直接注射入肌肉或甲状 腺及其它器官,使邻近的细胞摄入DNA 和这些基因所编码的产物的表达。在肌 肉中,基因表达可持续数月,但在甲状 腺中却仅能持续3-5天。 Wolf等曾将DNA和RNA表达载 体直接注射到多种组织中,包括血液 肝脏、皮肤、脑和肌肉等。结果以肌肉
存在于该被遗传修饰的细胞后裔中，并 且还要在该靶细胞中长时期有效表达。 1.1 基因转移的非病毒方法 虽然非病毒介导的基因转移效率 低且为瞬时表达，但也相对比较安全， 在美国及欧洲一些国家已将此方法用 于临床。先将其发展的主要方法分述如 下： 1 . 1 . 1 直 接 注 射 法 将 含 有 D N A 的 溶 液 （ 或 DNA 沉淀物）直接注射入肌肉或甲状 腺及其它器官，使邻近的细胞摄入 DNA 和这些基因所编码的产物的表达。在肌 肉中，基因表达可持续数月，但在甲状 腺中却仅能持续 3-5 天。 Wolff 等曾将 DNA 和 RNA 表达载 体直接注射到多种组织中，包括血液、 肝脏、皮肤、脑和肌肉等。结果以肌肉
最为成功。他们发现,注射的DNA在 肌细胞中以环状分子存在,不能复制, 亦不整合入宿主细胞的染色体中。这意 味着肌肉可用外源性DNA注射来做基 因治疗,但不能长久表达该基因;但是 肌肉内注射简单易行,故可以定期肌内 注射DNA。肌细胞是基因治疗的良好 靶细胞,特别对主要涉及肌肉的疾病, 如 Duchenne肌营养不良症(DMD) 但是对非原发于肌肉的疾病可能亦有 效 1.12磷酸钙共沉淀法 此方法由 Graham等人于1973年首 先建立的。当将氯化钙,DNA和磷酸 盐脂缓冲溶液(PBS)在一起缓慢混合 时,即有磷酸钙微细沉淀形成。如有培 养细胞存在时,形成的DNA-磷酸钙沉 淀物能附着在细胞膜上,并经过细胞内 吞作用而进入细胞浆中,并须通过溶酶 体。这些细胞事先要用氯化钙处理,使 其在与DNA样品混合时,核酸可以通 过细胞膜。然后继续培养并将转化子选 择出来。这种转化作用的主要好处是在 于其简单和普通性,其主要缺点是转化 频率通常很低(大约0.01-0.1%),故 需要有一个很强的选择性标志基因 由这类转移方法转入的DNA,大 多不整合入宿主细胞染色体,但能暂时 留在细胞核,以染色体外元件或附加体 的形式存在
最为成功。他们发现，注射的 DNA 在 肌细胞中以环状分子存在，不能复制， 亦不整合入宿主细胞的染色体中。这意 味着肌肉可用外源性 DNA 注射来做基 因治疗，但不能长久表达该基因；但是 肌肉内注射简单易行，故可以定期肌内 注射 DNA。肌细胞是基因治疗的良好 靶细胞，特别对主要涉及肌肉的疾病， 如 Duchenne 肌营养不良症（DMD）。 但是对非原发于肌肉的疾病可能亦有 效。 1.1.2 磷酸钙共沉淀法 此方法由Graham等人于1973年首 先建立的。当将氯化钙，DNA 和磷酸 盐脂缓冲溶液（PBS）在一起缓慢混合 时，即有磷酸钙微细沉淀形成。如有培 养细胞存在时，形成的 DNA-磷酸钙沉 淀物能附着在细胞膜上，并经过细胞内 吞作用而进入细胞浆中，并须通过溶酶 体。这些细胞事先要用氯化钙处理，使 其在与 DNA 样品混合时，核酸可以通 过细胞膜。然后继续培养并将转化子选 择出来。这种转化作用的主要好处是在 于其简单和普通性，其主要缺点是转化 频率通常很低（大约 0.01-0.1%），故 需要有一个很强的选择性标志基因。 由这类转移方法转入的 DNA，大 多不整合入宿主细胞染色体，但能暂时 留在细胞核，以染色体外元件或附加体 的形式存在
1 entrapped nucleic acid Cell membrane destabilization Neath and lipid fusion 脂质体转染法 阳 Cytopl 离子脂质体已经成 为重要的体外基因转移介质。可以在体 内或体外运载外源性遗传物质进入细 胞。阳离子脂质体与中性磷脂与DNA 形成由阳离子脂质包裹DNA的类脂复 合物。其大小、所带电荷及转移的效率 可通过改变复合物中类脂及DNA的组 成进行优化。 脂质体法现已广泛应用于基础研 究。脂质体介导的基因转移的最大优势 在于能在活体内应用,因为传统的 DNA转染法均不能用于活体内转染成 年动物 右图:脂质体介导转染示意图
1 . 1 . 3 脂 质 体 转 染 法 阳 离 子 脂 质 体 已 经 成 为重要的体外基因转移介质。可以在体 内或体外运载外源性遗传物质进入细 胞。阳离子脂质体与中性磷脂与 DNA 形成由阳离子脂质包裹 DNA 的类脂复 合物。其大小、所带电荷及转移的效率 可通过改变复合物中类脂及 DNA 的组 成进行优化。 脂质体法现已广泛应用于基础研 究。脂质体介导的基因转移的最大优势 在于能在活体内应用, 因为传统的 DNA 转染法均不能用于活体内转染成 年动物。 右图：脂质体介导转染示意图
1.14受体介导的基因转移 受体介导的基因转移方法是在质 粒DNA和某种特异的多肽(配体)之 间形成复合体,而这种多肽能被细胞表 面的受体所识别。这种方法使外源基因 可在活体内导向特异类型的细胞。然而 主要的问题是用受体介导的摄入法以 转移基因时,所形成的内产小泡常要被 送到溶酶体中而被降解。然而,通过应 用完整的腺病毒诱导含有DNA的小泡 破裂,可使所转移的DNA保持完整 并使其表达量显著增高。虽然应用受体 介导的基因转移方法所获得的结果很 有希望,但是资料显示,外源基因在活 体内表达是暂时性的。因此目前看来 此方法的应用前途可能有限 1.1.5 显微注射法该操作法分别由 Embryo implanted in uterus of surrogate mother Transgenic Mice
1.1.4 受体介导的基因转移 受体介导的基因转移方法是在质 粒 DNA 和某种特异的多肽（配体）之 间形成复合体，而这种多肽能被细胞表 面的受体所识别。这种方法使外源基因 可在活体内导向特异类型的细胞。然而, 主要的问题是用受体介导的摄入法以 转移基因时，所形成的内产小泡常要被 送到溶酶体中而被降解。然而，通过应 用完整的腺病毒诱导含有 DNA 的小泡 破裂，可使所转移的 DNA 保持完整， 并使其表达量显著增高。虽然应用受体 介导的基因转移方法所获得的结果很 有希望，但是资料显示，外源基因在活 体内表达是暂时性的。因此目前看来， 此方法的应用前途可能有限。 1 . 1 . 5 显 微 注 射 法 该 操 作 法 分 别 由 G r a s