第一篇组成人体的细胞 第二章基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域,抗体已被成功地应用于捕获靶分子(抗原)、亲和层 析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等诸多方向。这些技术所利用的其实就 是抗体与抗原发生特异性结合的特性,所有这些基于抗体的研究技术主要可被分 为四种类型:①利用抗体“示踪”靶分子;②利用抗体去捕获靶分子;③利用抗 体进行蛋白功能学研究;④通过和芯片技术的结合用于蛋白表达谱研究。 第一节抗体的标记 在绝大多数情况下,当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目 的之不同,所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 抗体的标记的直接法与间接法 (一)直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合,然后再与靶分子(抗原) 结合,通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子(抗原)进行定性、定位、定量 测量的方法。 (二)间接法 间接法与直接法不同,抗体既不需纯化也不需标记,而是在抗体与相应靶分 子(抗原)结合后,洗去未结合抗体,然后通过利用己标记好的第二抗体(二抗) 与一抗的结合来间接标记出靶分子(抗原)的存在情况。此方法带有比直接法更 多的标记物,因此较直接法灵敏。 标记物的选择 无论是直接法还是间接法,标记物的选择至关重要。表1-2-1所列出的就是 一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表1-2-1标记物的选择
第一篇 组成人体的细胞 第二章 基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域，抗体已被成功地应用于捕获靶分子（抗原）、亲和层 析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等诸多方向。这些技术所利用的其实就 是抗体与抗原发生特异性结合的特性，所有这些基于抗体的研究技术主要可被分 为四种类型：①利用抗体“示踪”靶分子；②利用抗体去捕获靶分子；③利用抗 体进行蛋白功能学研究；④通过和芯片技术的结合用于蛋白表达谱研究。 第一节 抗体的标记 在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目 的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 一、抗体的标记的直接法与间接法 （一）直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原） 结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量 测量的方法。 （二）间接法 间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分 子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗） 与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。此方法带有比直接法更 多的标记物，因此较直接法灵敏。 二、标记物的选择 无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。表 1-2-1 所列出的就是 一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表 1-2-1 标记物的选择
标记物 检测方法 优点 应用 生物素 与各种标记物偶保存时间长,灵步骤过多,存在免疫组化 联的亲和素与链敏度高,检测手内源性生物素干印迹 霉亲和素 段多样 扰,有些底物对 人体有害 荧光色素 荧光显微镜或荧保存时间长,分自发荧光,易淬免疫组化 光计 辨率高 灭 底物显色 保存时间长,灵步骤过多,存在免疫组化、免疫 敏度高,肉眼直内源性酶的干印迹 接可见,检测手扰,分辨率低, 段多样 有些底物对人体 有害 1251或131I Y计数仪、放射易于直接标记,半衰期短,对人免疫印迹、定性 自显影 灵敏度高 体有害 定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β不损伤抗体、操半衰期短,敏感免疫印迹、定性 计数仪 作简便 性低,需杂交瘤定量免疫分析 细胞 胶体金 显微镜、电镜、特异性强、灵敏对试剂、玻璃器免疫组化、流式 肉眼 度高、应用范围皿内的要求极细胞术、定性定 广、可用于双重高,标记物浓度量免疫分析 和多重标记较高 第二节免疫组织(细胞)染色技术 、基本概念 免疫组织化学技术( immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术 ( immunocytochemistry)是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗 原抗体反应和化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技 术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测 各种细胞组织成分,如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体(寄 生虫、细菌病毒)、受体、神经介质、肿瘤的标记物(抗原或相关抗原)等。是 免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段 免疫组织化学的全过程包括:①抗原的提取与纯化:②免疫动物或细胞融合, 制备特异性抗体以及抗体的纯化;③将显色剂与抗体结合形成标记抗体:④组织 细胞标本的制备;⑤免疫细胞化学反应及呈色反应;⑥结果的观察与分析
标记物 检测方法 优点 缺点 应用 生物素 与各种标记物偶 联的亲和素与链 霉亲和素 保存时间长，灵 敏度高，检测手 段多样 步骤过多，存在 内源性生物素干 扰，有些底物对 人体有害 免疫组化、免疫 印迹 荧光色素 荧光显微镜或荧 光计 保存时间长，分 辨率高 自发荧光，易淬 灭 免疫组化 酶 底物显色 保存时间长，灵 敏度高，肉眼直 接可见，检测手 段多样 步骤过多，存在 内源性酶的干 扰，分辨率低， 有些底物对人体 有害 免疫组化、免疫 印迹 125I 或 131I γ 计数仪、放射 自显影 易于直接标记， 灵敏度高 半衰期短，对人 体有害 免疫印迹、定性 定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β 计数仪 不损伤抗体、操 作简便 半衰期短，敏感 性低，需杂交瘤 细胞 免疫印迹、定性 定量免疫分析 胶体金 显微镜、电镜、 肉眼 特异性强、灵敏 度高、应用范围 广、可用于双重 和多重标记 对试剂、玻璃器 皿内的要求极 高，标记物浓度 较高 免疫组化、流式 细胞术、定性定 量免疫分析 第二节 免疫组织（细胞）染色技术 一、基本概念 免疫组 织化学 技 术 （ immunohistochemistry ） 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 （immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗 原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技 术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜 （包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测 各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄 生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等。是 免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段。 免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合， 制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将显色剂与抗体结合形成标记抗体；④组织 细胞标本的制备；⑤免疫细胞化学反应及呈色反应；⑥结果的观察与分析
、组织(细胞)标本的制备 (一)细胞标本的取材 1.体细胞取材方法 (1)印片法:主要用于从活组织检査标本和手术切除标本中获取细胞。首 先将标本剖开,最大程度暴露组织病变区,然后将载玻片轻压于病变组织区,吸 附脱落的细胞 (2)穿刺取样涂片法:用细针穿刺从实质性器官(如肝、肾、脾、淋巴结 软组织、骨髓)的病变区吸取病变区的体液,然后进行涂片 (3)体液沉淀涂片法:主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较 少的标本,先通过离心获取细胞沉淀,经适当稀释后再进行涂片。 2.培养细胞取材方法 (1)细胞爬片法:适合于贴壁生长的培养细胞。将干净(消毒处理)的盖 玻片放置入培养液中,细胞便会自然贴附在其上。 (2)涂片法:适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或 通过离心收集细胞,再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3.组织材料的获取主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分 为:冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 (二)细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来,让 蛋白质变性,使内源性消化酶失活。对免疫组化而言,可用的固定剂种类多样, 性能也不尽相同,在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响,防止抗原的弥 散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类(如10%的中性缓冲福尔马林,4%的多聚甲醛等)、 非醛类(如碳化二亚胺、对苯醌等)、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸 入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理,先将已 知的抗原或抗体标记上荧光素,进而再利用这种荧光抗体(或抗原)去检查细胞 或组织内的相应抗原(或抗体)。根据检测目的以及待检物的不同特点,免疫荧
二、组织（细胞）标本的制备 （一）细胞标本的取材 1．体细胞取材方法 （1）印片法：主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首 先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸 附脱落的细胞。 （2）穿刺取样涂片法：用细针穿刺从实质性器官（如肝、肾、脾、淋巴结、 软组织、骨髓）的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。 （3）体液沉淀涂片法：主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较 少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。 2．培养细胞取材方法 （1）细胞爬片法：适合于贴壁生长的培养细胞。将干净（消毒处理）的盖 玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。 （2）涂片法：适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或 通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3．组织材料的获取 主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分 为：冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 （二）细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让 蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样， 性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥 散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类（如 10％的中性缓冲福尔马林，4％的多聚甲醛等）、 非醛类（如碳化二亚胺、对苯醌等）、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸 入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已 知的抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体（或抗原）去检查细胞 或组织内的相应抗原（或抗体）。根据检测目的以及待检物的不同特点，免疫荧
光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式 (一)荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸( fluorescein-5- isothiocyanate,FTC)、四 乙基罗丹明( tetraethylrod amine B200,RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate)、藻红蛋白( phycoerythrin,PE)等,它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光 1.异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 (1)所需试剂及设备 )试剂:被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH9~9.5的碳酸 盐缓冲液(NaCO34.3g、NaCO386g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中)、PBS 缓冲液(pH72)、DMSO 2)材料与设备:透析袋、紫外分光光度计、 Sephadex g25柱等。 (2)操作步骤 1)将纯化过的抗体放入透析袋中,在加有pH9~9.5的碳酸盐缓冲液容器 中4℃透析过夜,透析后抗体被转移到一小烧杯中备用 2)配制FITC-DMSO溶液:称取适量FITC,加入DMSO溶解,使FITC终 浓度保持在1mgm左右。 3)按照适当比例将 FITC-DMSO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。(通 常,当IgG的浓度为lmgm时,FITC的加入量为5μg/ml;当IgG的浓度为 5~10mgm时FIC的加入量则降为25ug/ml)。 4)将上述标记物用PBS稀释至2.5ml,室温下避光搅拌2h 5)用 Sephadex G25柱除去游离荧光素分子,收集第一个PBS洗脱峰(荧 光素蛋白结合峰),按照下式计算F/P值 F/P=287×A495A280-0.35×A495,其中A495、A280分表代表495nm、280nm 下的光吸收值,适当的F/P值应在2~4之间。 6)分装,4℃避光保存备用。 2.四乙基罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:四乙基罗丹明(RB200)、无水丙醇、生理盐水、pH 9~9.5的碳酸盐缓冲液(同上)、透析袋和 Sephadex G50柱等
光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。 （一）荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸（fluorescein-5-isothiocyanate，FITC）、四 乙基罗丹 明（tetraethylrodamine B200 ，RB200）、四 甲基异 硫氰酸 罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate）、藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等，它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。 1．异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 （1）所需试剂及设备 1）试剂：被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9～9.5 的碳酸 盐缓冲液（Na2CO3 4.3g、NaHCO3 8.6g 溶入到终体积为 500ml 的蒸馏水中）、PBS 缓冲液（pH7.2）、DMSO； 2）材料与设备：透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25 柱等。 （2）操作步骤 1）将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有 pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液容器 中 4℃透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。 2）配制 FITC-DMSO 溶液：称取适量 FITC，加入 DMSO 溶解，使 FITC 终 浓度保持在 1mg/ml 左右。 3）按照适当比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。（通 常，当 IgG 的浓度为 1mg/ml 时，FITC 的加入量为 50µg／ml；当 IgG 的浓度为 5～10mg/ml 时,FITC 的加入量则降为 25µg／ml）。 4）将上述标记物用 PBS 稀释至 2.5ml，室温下避光搅拌 2h。 5）用 Sephadex G25 柱除去游离荧光素分子，收集第一个 PBS 洗脱峰（荧 光素蛋白结合峰），按照下式计算 F/P 值。 F/P＝2.87×A495/A280-0.35×A495，其中 A495、A280 分表代表 495nm、280nm 下的光吸收值, 适当的 F/P 值应在 2～4 之间。 6）分装，4℃避光保存备用。 2．四乙基罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：四乙基罗丹明（RB200）、无水丙醇、生理盐水、pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液（同上）、透析袋和 Sephadex G50 柱等
(2)操作步骤 1)称取lgRB200和2gPCl(五氯化磷)于研钵中仔细研磨5min后加入 loml无水乙醇不断搅拌5min,再用滤纸过滤上述溶液,所得滤液将被用于抗体 标记。(注:RB200可在PCls的作用下转变成磺酰氯SO2Cl,后者在碱性条件下 可与蛋白质的E氨基结合从而实现对抗体的标记。) 2)取抗体(浓度一般在20mg/ml左右)适量,按照每ml抗体各加入1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释,然后逐滴加入O. ImI rB200溶液,边加边 搅拌。 3)0~4℃结合12~18h,再用生理盐水透析5~7h 4)经 Sephadex G50柱层析,除去游离荧光素。 5)分装,4℃避光保存备用。 3.藻红蛋白标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体(25mg/hm1)、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂( SPDPH和SMCC):SPDP[3-(2- pyridyl thio) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester] SMCC [succ inimidyltrans-4-(N-male imidylmethy cyclohexane-l- carbox late(注:SPDP用甲醇配成1.3mg/m浓度,SMCC用甲醇 配成1.πmg/m浓度备用)、77mg/ml二硫苏糖醇(DTT)、O.lmMN-乙基顺丁烯 二酰亚胺( N-ethy male imide,NEM)、不含Ca2、Mg2+的PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25柱和 Sephacryl S-300柱等。 (2)操作步骤 1)取0.25ml保存在60%(NH)SO4中的PE(4mg/mnl),经离心弃掉上清, 并用025 mI PBs重悬。 2)将上述重悬的PE溶液在室温下用150 mI PBS透析30min,期间换液两次 3)调整透析后的PE溶液浓度在14mgm(共约有0.7ml体积),加入16μul SPDP,室温孵育2~3h。 4)取纯化的抗体lm(2.5mg/ml),加入20μ I SMCC溶液,室温孵育1h, 制备SMCC-抗体交联物。 5)加入30山lDTT溶液到第三步交联好的SPDP-PE中,室温孵育30min。 6)用 Sephadex g25柱层析纯化SPDP-PE和SMCC-抗体交联物
（2）操作步骤 1）称取 1g RB200 和 2g PCl5（五氯化磷）于研钵中仔细研磨 5min 后加入 10ml 无水乙醇不断搅拌 5min，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体 标记。（注：RB200 可在 PCl5 的作用下转变成磺酰氯 SO2Cl，后者在碱性条件下 可与蛋白质的 ε-氨基结合从而实现对抗体的标记。） 2）取抗体（浓度一般在 20mg/ml 左右）适量，按照每 ml 抗体各加入 1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入 0.1ml RB200 溶液,边加边 搅拌。 3）0～4℃结合 12～18h，再用生理盐水透析 5～7h。 4）经 Sephadex G50 柱层析，除去游离荧光素。 5）分装，4℃避光保存备用。 3．藻红蛋白标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体（2.5mg/ml）、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂（SPDPH 和 SMCC）：SPDP[3-（2-pyridyldithio）propionic acid N-hydroxysuccinimide ester]、SMCC [succinimidyltrans-4-（N-maleimidylmethy） cyclohexane-1-carboxlate]（注：SPDP 用甲醇配成 1.3mg/ml 浓度，SMCC 用甲醇 配成 1.7mg/ml 浓度备用）、77mg/ml 二硫苏糖醇（DTT）、0.1mM N-乙基顺丁烯 二酰亚胺（N-ethy maleimide，NEM）、不含 Ca2＋、Mg2＋的 PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25 柱和 Sephacryl S-300 柱等。 （2）操作步骤 1）取 0.25ml 保存在 60％(NH)4SO4 中的 PE（4mg/ml），经离心弃掉上清， 并用 0.25ml PBS 重悬。 2）将上述重悬的 PE 溶液在室温下用 150ml PBS 透析 30min，期间换液两次。 3）调整透析后的 PE 溶液浓度在 1.4mg/ml（共约有 0.7ml 体积），加入 16µl SPDP，室温孵育 2～3h。 4）取纯化的抗体 1ml（2.5mg/ml），加入 20µl SMCC 溶液，室温孵育 1h， 制备 SMCC-抗体交联物。 5）加入 30µl DTT 溶液到第三步交联好的 SPDP－PE 中，室温孵育 30min。 6）用 Sephadex G25 柱层析纯化 SPDP－PE 和 SMCC-抗体交联物