第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控 进行研究,是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中,逐步建立起 系列行之有效的技术。针对不同的研究内容,可建立不同的研究路线。 第一节PCR技术 聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)技术是一种体外核酸扩增 技术,具有特异、敏感、产率髙、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完 善,成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使 特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段 可以直接通过电泳观察,并作进一步的分析 、实验原理 PCR是根据DNA变性复性的原理,通过特异性引物,完成特异片段扩增。 第一,按照欲检测的DNA的5′和3′端的碱基顺序各合成一段长约18~24个 碱基的寡核苷酸序列作为引物( primer)。引物设计需要根据以下原则:①引物 的长度保持在18~24bp之间,引物过短将影响产物的特异性,而引物过长将影 响产物的合成效率;②GC含量应保持在45~60%之间;③5′和3′端的引物间 不能形成互补。第二,将待检测的DNA变性后,加入四种单核苷酸(dNTP) 引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性,在进入较低的温度使引物 与待扩增的DNA链复性结合,然后在聚合酶的作用下,体系中的脱氧核苷酸与 模板DNA链互补配对,不断延伸合成新互补链,最终使一条DNA双链合成为 两条双链。通过变性(92~95℃)→复性(40~60℃)→引物延伸(65~72℃) 的顺序循环20至40个周期,就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周 期可使DNA扩增100余万倍
第二篇 细胞的遗传物质 第三章 基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控 进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一 系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。 第一节 PCR 技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增 技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR 技术日斟完 善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用 PCR 技术可以使 特定的基因或 DNA 片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段 可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。 一、实验原理 PCR 是根据 DNA 变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。 第一，按照欲检测的 DNA 的 5＇和 3＇端的碱基顺序各合成一段长约 18～24 个 碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：①引物 的长度保持在 18～24bp 之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影 响产物的合成效率；②GC 含量应保持在 45～60%之间；③5＇和 3＇端的引物间 不能形成互补。第二，将待检测的 DNA 变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、 引物和耐热 DNA 聚合酶以及缓冲液。通过 95℃变性，在进入较低的温度使引物 与待扩增的 DNA 链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与 模板 DNA 链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条 DNA 双链合成为 两条双链。通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃） 的顺序循环 20 至 40 个周期，就可以得到大量的 DNA 片段。理论上循环 20 周 期可使 DNA 扩增 100 余万倍
、PCR技术的分类及其应用范围 1.逆转录PCR逆转录PCR( RT-PCR)是将RNA反转录和PCR结合而 建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程:通过逆转录合成cDNA和对之进 行PCR扩增。其中,用于逆转录的RNA模板要求完整,并且不含DNA和蛋白 质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。 2.原位PCR原位PCR技术( in situ pcr)是将检测细胞内特定基因的原 位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞 内微量的基因,并将其检测出来的技术。 3.甲基化PCR甲基化PCR与常规PCR在原理上一致,但在引物的设计 以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域,一般需要设 计三条引物:正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三 组PCR,判断DNA序列中甲基化的存在与否 4.实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR( real time quantitative PCr)是 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进 程,并能对起始模板进行定量分析。 RT-PCR需要荧光探针参与,常用的探针可 分为以下几类:1)内掺式染料 SYBR Green I:2)序列特异性探针: Taqman Molecular beacons, Dual probes;3)特异性引物: Amplifluor( Intergen),Lux 引物, Scorpion;4)阴阳探针。 荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量,用于临床诊断,而且可以应用不同 的探针检测基因突变和SNP分析。 5.多重引物PCR多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物,同时扩 增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或 同一疾病的几个不同的基因突变 6.随机引物PCR多态DNA的随机扩增( random amplication of polymorphic DNA,RAPD)或随机引物PCR( arbitrarily primed PCR, AP PCR 是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物,通过PCR扩增产生一组代表种 或株特性的DNA片段。因此,RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通 用方法 7.套式PCR又称巢式PCR,是对靶DNA片段设计两套引物系统,第1
二、PCR 技术的分类及其应用范围 1．逆转录 PCR 逆转录 PCR（RT-PCR）是将 RNA 反转录和 PCR 结合而 建立起来的一种 PCR 技术。其包括两个过程：通过逆转录合成 cDNA 和对之进 行 PCR 扩增。其中，用于逆转录的 RNA 模板要求完整，并且不含 DNA 和蛋白 质等杂质。逆转录 PCR 可以检测低于 10 个拷贝的特异 RNA。 2．原位 PCR 原位 PCR 技术（in situ PCR）是将检测细胞内特定基因的原 位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞 内微量的基因，并将其检测出来的技术。 3．甲基化 PCR 甲基化 PCR 与常规 PCR 在原理上一致，但在引物的设计 以及 DNA 样本的处理上有所不同。针对扩增的 DNA 甲基化区域，一般需要设 计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及 DNA 序列修饰引物。通过三 组 PCR，判断 DNA 序列中甲基化的存在与否。 4．实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR（real time quantitative PCR）是 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个 PCR 进 程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR 需要荧光探针参与，常用的探针可 分为以下几类：1）内掺式染料 SYBR Green I；2）序列特异性探针：Taqman， Molecular Beacons， Dual Probes； 3）特异性引物： Amplifluor（Intergen）， Lux 引物， Scorpion； 4）阴阳探针。 荧光定量 PCR 不仅可以测定靶 DNA 的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同 的探针检测基因突变和 SNP 分析。 5．多重引物 PCR 多重引物 PCR 是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩 增多个基因片段的 PCR 技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或 同一疾病的几个不同的基因突变。 6．随机引物 PCR 多态 DNA 的随机扩增 （random amplication of polymorphic DNA，RAPD）或随机引物 PCR（arbitrarily primed PCR，AP PCR） 是应用基因组 DNA 中单一、随机序列的短引物，通过 PCR 扩增产生一组代表种 或株特性的 DNA 片段。因此，RAPD 是获得种或株的 DNA 分子指纹图谱的通 用方法。 7．套式 PCR 又称巢式 PCR，是对靶 DNA 片段设计两套引物系统，第 1
套引物扩增15~30个循环,再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增15~ 30个循环,可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非 特异性扩增,增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。 8.突变体构建PCR (1)应用载体构建突变体的PCR:原理是将野生型目的基因的cDNA插入 到克隆载体上,设计携带突变点的一对引物,对克隆载体进行扩増,然后将经过 PCR而获得的DNA转染感受态细胞,并用筛选培养基筛选转染的细胞,获得的 克隆可以通过细胞扩增,获得大量的携带突变体DNA的载体。 (2)应用内外引物构建突变体的PCR:载体构建突变体PCR是构建点突变 的高效方法,但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体 PCR可以克服载体构建突变体PCR的不足。其原理是合成两对引物,即一对扩 增整个cDNA的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个 外引物与一个内引物进行PCR,可以获得两条DNA序列,该两条DNA在突变 位点存在部分重合。去除引物,将两条DNA变性,而后进行复性,将可导致两 条DNA重合部分互补,并在Taq酶的作用下补齐3′末端。用外引物扩增DNA, 将获得含有突变的cDNA。 PCR引物的设计是PCR成功的关键,必须遵守以下原则:①确定扩增区域 及其长度;②确定引物的Tm值;③避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹 结构等二级结构的形成;④具有扩增的特异性 三、应用PCR技术检测性别决定基因 (一)实验原理 SRY基因又称睾丸决定基因( Testis determ ining factor),位于人类Y染色体, 在ⅹ染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物, 通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段,以及患者的表型可对患者的 真正性别和病因作出判断,另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病 患儿的出生。 (二)实验准备 1.材料人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、15m及0.5 ml Eppendorf 管。引物序列:(SRY:5′ GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAG TG-3’;SRY2
套引物扩增 15～30 个循环，再用扩增的 DNA 片段内设定的第 2 套引物扩增 15～ 30 个循环，可使目的 DNA 序列得到高效扩增。套式引物 PCR 可减少引物的非 特异性扩增，增加特异性扩增,减少 PCR 的误诊率。 8．突变体构建 PCR （1）应用载体构建突变体的 PCR：原理是将野生型目的基因的 cDNA 插入 到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过 PCR 而获得的 DNA 转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的 克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体 DNA 的载体。 （2）应用内外引物构建突变体的 PCR：载体构建突变体 PCR 是构建点突变 的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体 PCR 可以克服载体构建突变体 PCR 的不足。其原理是合成两对引物，即一对扩 增整个 cDNA 的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个 外引物与一个内引物进行 PCR，可以获得两条 DNA 序列，该两条 DNA 在突变 位点存在部分重合。去除引物，将两条 DNA 变性，而后进行复性，将可导致两 条 DNA 重合部分互补，并在 Taq 酶的作用下补齐 3＇末端。用外引物扩增 DNA， 将获得含有突变的 cDNA。 PCR 引物的设计是 PCR 成功的关键，必须遵守以下原则：①确定扩增区域 及其长度；②确定引物的Ｔｍ值；③避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹 结构等二级结构的形成；④具有扩增的特异性。 三、应用 PCR 技术检测性别决定基因 （一）实验原理 SRY 基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类 Y 染色体， 在 X 染色体上没有相应的同源节段。根据 SRY 基因序列合成一对特异性引物， 通过 PCR 反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的 真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病 患儿的出生。 （二）实验准备 1. 材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml 及 0.5ml Eppendorf 管。引物序列：（SRY1：5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′；SRY2：
5'-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3' 2.试剂(实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理) 生理盐水、细胞裂解液(50 mmol tris-HCl,pH8.0; I mmol na2EDTA,pH 80:05%SDS;0.1 mmol naCl)、10mg/ml蛋白酶K、20%SDS、水饱和酚(1mo Tris-HCl抽提)、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)、8mol 醋酸钾、无水乙醇、0%乙醇、TE(pH80)(l0 mmolL Tris-HC,pH8.0;0.1 mmol/L Na2EDtA,pH80)、10× buffer( 500mmol/L KCl、100 mmol/L TrisHCl,pH8.3, 室温15 mmol/L MgCh2;0.1%明胶)、4×dNTP(1 mmol/LdAP,1mmo/ L dcTP 1 mmol/l dGTP,1 mmol/l dTTP)、Taq酶(lU/μl1)、引物溶液(l0 pmol/ul)、5×TBE 缓冲液(1000ml)(54 g Tris碱,27.5g硼酸,20ml0.5 MOIL EDTA,pH8.0)、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液(l0oσm〕(0.2%溴酚蓝,50%蔗糖, l0 mol/l Naoh1~2滴)、10mgml溴化乙锭溶液(戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg,放入棕色瓶中,加重蒸水20m,溶解后置4℃冰箱保存备用。使用时100n 琼脂糖凝胶中加5μll0mg/ml溴化乙锭溶液,终浓度为0.5ugml)。 3.实验仪器PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 (三)实验步骤 1.DNA模板制备 方法I:取毛发1~2根,尽量剪碎,于15~20m生理盐水中100℃水浴10min 离心取上清备用。 方法Ⅱ:外周血提取DNA (1)白细胞的分离 ①抗凝血用1~2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水(PBS)稀释并混合。 ②在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),在上面 仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。 ③室温以2000pm离心15min~20min,红细胞应沉于管底,而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆,小心吸取淋巴细胞层,直至把淋巴细胞转移完全 ⑤用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次
5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′） 2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理） 生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na2 EDTA ，pH 8.0；0.5% SDS；0.1mmol NaCl）、10mg/ml 蛋白酶 K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L Na2EDTA，pH8.0）、10×buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·HCl，pH8.3， 室温 15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4×dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP， 1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/μl）、引物溶液（10pmol/μl）、5×TBE 缓冲液（1000ml）（54g Tris 碱，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖， 10mol/L NaOH 12 滴）、10mg/ml 溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水 20ml，溶解后置 4℃冰箱保存备用。使用时 100ml 琼脂糖凝胶中加 5μl 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为 0.5μg/ml）。 3. 实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 （三）实验步骤 1. DNA 模板制备 方法Ⅰ：取毛发 12 根，尽量剪碎，于 1520ml 生理盐水中 100℃水浴 10min， 离心取上清备用。 方法Ⅱ：外周血提取 DNA （1）白细胞的分离 ①抗凝血用 1～2 倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 ②在 50ml 离心管中加入 1 倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面 仔细铺一层 2 倍体积已稀释的血液。 ③室温以 2000rpm 离心 15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。 ⑤用生理盐水或 PBS 洗淋巴细胞二次
⑥最后得到的淋巴细胞沉淀,可立即用于DNA的提取,或冻存于超低温冰 箱中,直至使用。 (2)DNA的提取(见本篇第一章)。 2.PCR反应体系配制及扩增 (1)PCR反应总体积50ul,取一洁净的0.5 ml Eppendorf管,依次加入: 0× buffer dNTP 5ul 引物1 引物2 2.5u 模板DNA 10ul Taq dna daHaO 补足50ul (2)将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应,条件为94℃变性10min 后,94℃45s、55℃45s、72℃90s共30个循环;最末一个循环紧接72℃再延伸 l0min。 3.扩增产物电泳检测 取PCR扩增产物10ul与2山l上样缓冲液混合后,与 DNA Marker同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束,取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 (四)注意事项 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2.PCR常见问题及解决办法 (1)没有得到预期的PCR扩增产物:①确证聚合酶的活性是否正常;② DNA解链是否充分,变性温度是否准确;③引物组成是否正确,有无二级结构 组成;④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在,使聚合酶或模板及产物降解。 (2)有非特异性扩增产物出现:①增加复性温度,缩短复性时间及延伸时 间;②降低引物和 Taq dna聚合酶的用量;③调整Mg2+浓度;④减少热循环次 (3)形成了引物二聚体:①检查引物的序列,特别是3′端是否有互补区
⑥最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于 DNA 的提取，或冻存于超低温冰 箱中，直至使用。 （2）DNA 的提取（见本篇第一章）。 2. PCR 反应体系配制及扩增 （1）PCR 反应总体积 50μl，取一洁净的 0.5ml Eppendorf 管，依次加入： 10×buffer 5μl dNTP 5μl 引物 1 2.5μl 引物 2 2.5μl 模板 DNA 10μl Taq DNA 2U d3H2O 补足 50μl （2）将反应管放入 PCR 扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为 94℃变性 10min 后，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 90s 共 30 个循环；最末一个循环紧接 72℃再延伸 10min。 3. 扩增产物电泳检测 取 PCR 扩增产物 10μl 与 2μl 上样缓冲液混合后，与 DNA Marker 同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 （四）注意事项 1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2. PCR 常见问题及解决办法 （1）没有得到预期的 PCR 扩增产物：①确证聚合酶的活性是否正常；② DNA 解链是否充分，变性温度是否准确；③引物组成是否正确，有无二级结构 组成；④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。 （2）有非特异性扩增产物出现：①增加复性温度，缩短复性时间及延伸时 间；②降低引物和 Taq DNA 聚合酶的用量；③调整 Mg2+浓度；④减少热循环次 数。 （3）形成了引物二聚体：①检查引物的序列，特别是 3′端是否有互补区；