sman和 Dia Cumakes建立。在显微镜 下,将DNA由细胞玻璃针直接注入细 胞。可以将DNA直接注入核内而减少 了溶酶体对外源DNA的消化酶解,有 助于基因的多拷贝整合与表达。由于 DNA是以溶液状态进入细胞的,所 各DNA分子可以以不同方向、不同位 置整合到染色体上,避免了磷酸钙沉淀 法多拷贝中联带来的多拷贝间的顺式 影响,更有利于各份DNA的有效表达 该法适用于将外源基因转入胚胎,制备 转基因动物。由于其转染的细胞数目极 为有限,在体细胞治疗中很少应用 右图:图A示镜下的纤维注射操作 图B为转基因小鼠的制作流程。 1.1.6电穿孔法 它利用脉冲电场将DNA导入培养 细胞.由于电穿孔后进入细胞的DNA
sman 和 Dia Cumakes 建立。在显微镜 下，将 DNA 由细胞玻璃针直接注入细 胞。可以将 DNA 直接注入核内而减少 了溶酶体对外源 DNA 的消化酶解，有 助于基因的多拷贝整合与表达。由于 DNA 是以溶液状态进入细胞的，所以 各 DNA 分子可以以不同方向、不同位 置整合到染色体上，避免了磷酸钙沉淀 法多拷贝中联带来的多拷贝间的顺式 影响，更有利于各份 DNA 的有效表达。 该法适用于将外源基因转入胚胎，制备 转基因动物。由于其转染的细胞数目极 为有限，在体细胞治疗中很少应用。 右图：图 A 示镜下的纤维注射操作。 图 B 为转基因小鼠的制作流程。 1.1.6 电穿孔法 它利用脉冲电场将 DNA 导入培养 细胞. 由于电穿孔后进入细胞的 DNA
拷贝数很有限,所以传代后的细胞外源 基因大多数以单拷贝形式存在可以用 两种方法来增加外源基因在细胞中的 对拷贝数:一,使具有相同的表达产物 基困而不同选择基因的质粒共转染,然 后细胞在含两种选择剂的培养液中培 养,选择后细胞多数含两拷贝的表达产 物基因;其二,用带选择基因和表达产 物基因同仅含表达产物基因的质粒共 转染,两者的量比例前者比后者应越小 越好,并且前者DNA量少一点较好 通过单一选择剂的选择,可望得到多拷 贝的转化细胞 右图:多功能细胞电穿孔仪 1.17微离子轰击法 使用高能微粒子轰击将DNA劲培 养细胞或活的哺乳动物组织内,在贴壁 细胞、悬浮细胞、活体组织中均能很好 表达。亚微粒的钨和金能自发地吸附 DNA,将这些”微弹”加速到很快的速 度轰击细胞。微粒子进入细胞后,DNA 将逐渐从粒子中释放出来,并进行基因 表达。这一方法已用于植物基因工程及 在培养的各类细胞,包括人类表皮细 胞、内皮细胞、成纤维细胞等等。其优 点是可直接对在体器官进行转移,有广 阔应用前景。微粒子轰击后可使104 105的细胞发生DNA整合。 12基因转移的病毒方法 逆转录病毒载体 DNA病毒载体 121逆转录病毒载体
拷贝数很有限, 所以传代后的细胞外源 基因大多数以单拷贝形式存在. 可以用 两种方法来增加外源基因在细胞中的 对拷贝数: 一, 使具有相同的表达产物 基困而不同选择基因的质粒共转染, 然 后细胞在含两种选择剂的培养液中培 养, 选择后细胞多数含两拷贝的表达产 物基因; 其二, 用带选择基因和表达产 物基因同仅含表达产物基因的质粒共 转染, 两者的量比例前者比后者应越小 越好, 并且前者 DNA 量少一点较好, 通过单一选择剂的选择, 可望得到多拷 贝的转化细胞 右图：多功能细胞电穿孔仪 1.1.7 微离子轰击法 使用高能微粒子轰击将 DNA 劲培 养细胞或活的哺乳动物组织内，在贴壁 细胞、悬浮细胞、活体组织中均能很好 表达。亚微粒的钨和金能自发地吸附 DNA，将这些”微弹” 加速到很快的速 度轰击细胞。微粒子进入细胞后，DNA 将逐渐从粒子中释放出来，并进行基因 表达。这一方法已用于植物基因工程及 在培养的各类细胞，包括人类表皮细 胞、内皮细胞、成纤维细胞等等。其优 点是可直接对在体器官进行转移，有广 阔应用前景。微粒子轰击后可使 10-4～ 10-5 的细胞发生 DNA 整合。 1.2 基因转移的病毒方法 逆转录病毒载体 DNA 病毒载体 1.2.1 逆转录病毒载体
反转录病毒( retrovirus)是一类已 知的RNA病毒。该载体系统有两部分 组成,一是带有外源基因的重组反转录 病毒载体分子,二是能以反式提供病毒 结构蛋白的包装细胞,其要求是能高效 产生感染靶细胞的重组病毒颗粒,且无 野生型的反转录病毒存在,后者是基因 治疗安全性的关键问题。 Retrovirus proteins chromosomal 转录病毒载体最大优点是 transection Provirus 染谱广,可以感 染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细 胞、肌细胞等;(2)转入的外源基因可 完全整合;(3)对细胞感染率高,达到 100%;(4)感染细胞不产生病变,可 建立细胞系长期持续表达外源基因。但 也有不足之处,如:(1)只能整合至分 裂相细胞;(2)可插入外源基因片断小 (<10kb),难以满足较大基因的插入; (3)病毒滴度是限制临床应用的主要 方面;(4)有产生野生型病毒或辅助型 病毒的可能,随机整合可能产生不良作 用
反转录病毒（retrovirus）是一类已 知的 RNA 病毒。该载体系统有两部分 组成，一是带有外源基因的重组反转录 病毒载体分子，二是能以反式提供病毒 结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效 产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无 野生型的反转录病毒存在，后者是基因 治疗安全性的关键问题。 逆 转 录 病 毒 载 体 最 大 优 点 是 : （ 1 ） 转 染 谱 广 ， 可 以 感 染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细 胞、肌细胞等;（2）转入的外源基因可 完全整合;（3）对细胞感染率高，达到 100%;（4）感染细胞不产生病变，可 建立细胞系长期持续表达外源基因。但 也有不足之处，如:（1）只能整合至分 裂相细胞;（2）可插入外源基因片断小 （<10kb），难以满足较大基因的插入; （3）病毒滴度是限制临床应用的主要 方面;（4）有产生野生型病毒或辅助型 病毒的可能，随机整合可能产生不良作 用
根据报道利用逆转录病毒作为载 体来进行血友病A的基因治疗已经有 了很大的进展。在累积了大量动物实验 成功的经验基础上,目前已有一个运用 浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型 MO-MLV病毒载体介导FⅧ在体内表 达的Ⅰ期临床试验正在进行之中。1999 年Gao等人在大鼠实验中先肌肉内注 射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基 因(HGF),然后经逆转录病毒转染目 标基因,观察其表达情况。在研究组中 发现血液和肝内有高水平的HGF表 达,且测得3%~12%肝细胞进行分裂 肌肉内注射腺病毒介导的HGF在第1 天浓度最高,此时立刻输注逆转录病毒 介导的β半乳糖苷酶(日标基因),约 有8%肝细胞被转染。这一研究成果给 临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者 带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜 性不同,可将其分为单嗜性逆转录病 毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录 病毒3类,目前研究使用较多的是兼嗜 性逆转录病毒 右图:逆转录病毒的生命周期 122DNA病毒载体 腺病毒载体
根据报道利用逆转录病毒作为载 体来进行血友病 A 的基因治疗已经有 了很大的进展。在累积了大量动物实验 成功的经验基础上，目前已有一个运用 浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型 MO-MLV 病毒载体介导 FⅧ在体内表 达的Ⅰ期临床试验正在进行之中。1999 年 Gao 等人在大鼠实验中先肌肉内注 射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基 因（HGF），然后经逆转录病毒转染目 标基因，观察其表达情况。在研究组中 发现血液和肝内有高水平的 HGF 表 达，且测得 3%～12%肝细胞进行分裂。 肌肉内注射腺病毒介导的 HGF 在第 1 天浓度最高，此时立刻输注逆转录病毒 介导的 β 半乳糖苷酶（目标基因），约 有 8%肝细胞被转染。这一研究成果给 临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者 带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜 性不同，可将其分为单嗜性逆转录病 毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录 病毒 3 类，目前研究使用较多的是兼嗜 性逆转录病毒。 右图：逆转录病毒的生命周期 1.2.2 DNA 病毒载体 腺病毒载体
fiber hexon double stranded DNA single-stranded DNA 病毒载体感染宿主的范围比较广,可以感染非分裂 exon 期细胞,在体内疗法的基因转移中具有 很大的优势,而且由于其感染细胞时 DNA不整合到宿主染色体上,不存在 激活致癌基因或插入突变等危险,制备 容易,操作简单,因此倍受人们关注 腺病毒( adenovirus,Ad)是一种 无包膜的线状双链DNA病毒,其复制 不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个 血清型,大多数Ad载体由Ad5和Ad2 构建而来,载体需要在其包装系的帮助 下扩增,另外,通过同源重组的方法, 与一带外源基因和适当的腺病毒序列 的质粒共转染,亦可产生载体。 Ad载体具有以下优点:(1)人类是 Ad的自然宿主,因此比较安全;(2)靶 细胞范围广,不仅能感染复制分裂细 胞,也能感染非分裂细胞,它可介导体 内多种组织的基因转移,如肺、脑、肌 肉、神经系统、血管等;(3)滴度高 可达1011~1012pum;(4)可在肠道 及呼吸道内繁殖,其重组病毒可由静脉 注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方
腺 病 毒 载 体 感 染 宿 主 的 范 围 比 较 广 ， 可 以 感 染 非 分 裂 期细胞，在体内疗法的基因转移中具有 很大的优势，而且由于其感染细胞时 DNA 不整合到宿主染色体上，不存在 激活致癌基因或插入突变等危险，制备 容易，操作简单，因此倍受人们关注。 腺病毒（adenovirus，Ad）是一种 无包膜的线状双链 DNA 病毒，其复制 不依赖于宿主细胞的分裂。有近 50 个 血清型，大多数 Ad 载体由 Ad5 和 Ad2 构建而来，载体需要在其包装系的帮助 下扩增，另外，通过同源重组的方法， 与一带外源基因和适当的腺病毒序列 的质粒共转染，亦可产生载体。 Ad 载体具有以下优点:（1）人类是 Ad 的自然宿主，因此比较安全;（2）靶 细胞范围广，不仅能感染复制分裂细 胞，也能感染非分裂细胞，它可介导体 内多种组织的基因转移，如肺、脑、肌 肉、神经系统、血管等;（3）滴度高， 可达 1011～1012pfu/ml;（4）可在肠道 及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉 注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方