复旦大学：《细胞与医学遗传学实验》实验内容_细胞的遗传物质_染色体分析相关的实验.doc

第二篇细胞的遗传物质第四章染色体分析相关的实验染色体是细胞与分子联系的重要桥梁,染色体的研究在遗传学和医学研究中被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了一个新的台阶。在染色体分析技术实验中,染色体非显带分析技术相对较简单,通常采用外周血中的淋巴细胞。外周血染色体制备也是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术。此外,产前诊断时,胎儿可采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的,它能显示染色体本身更细微的结构,有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。G(G band ing)显带技术是目前通常采用的显带技术之一,另外,Q显带、高分辨显带、 C显带、T显带及SCE技术等也被用于染色体研究随着分子细胞遗传学技术的应用,可利用克隆的DNA探针(含有荧光标记) 来定位染色体上特定基因和DNA序列,如荧光原位杂交(FISH)技术,可以鉴别经典细胞遗传学方法所难以识别的微小标记染色体、微小缺失和复杂易位等第一节人类染色体标本的制备、概述在一般的生理状态下,全血中含有红、白细胞二类,它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核无分裂能力;白细胞虽有细胞核存在,但是在外周血中已处于休止期(G0),因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。现在最常用的促使分裂的药品是植物血凝素( phytohemagg! lutein,PHA), 它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞,这就为染色体的制备创造了条件。在PHA的作用下,处在G0期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞,重新进入增殖周期进行有丝分裂,当体外培养至70h左右时,大多数淋巴细胞己处于第二増殖周期内,此时用秋水仙素( colchicine)处理细胞可使正在

1 第二篇细胞的遗传物质第四章染色体分析相关的实验染色体是细胞与分子联系的重要桥梁，染色体的研究在遗传学和医学研究中被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了一个新的台阶。在染色体分析技术实验中，染色体非显带分析技术相对较简单，通常采用外周血中的淋巴细胞。外周血染色体制备也是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术。此外，产前诊断时，胎儿可采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。G（G banding）显带技术是目前通常采用的显带技术之一，另外，Q 显带、高分辨显带、 C 显带、T 显带及 SCE 技术等也被用于染色体研究。随着分子细胞遗传学技术的应用，可利用克隆的 DNA 探针(含有荧光标记) 来定位染色体上特定基因和 DNA 序列，如荧光原位杂交（FISH）技术，可以鉴别经典细胞遗传学方法所难以识别的微小标记染色体、微小缺失和复杂易位等。第一节人类染色体标本的制备一、概述在一般的生理状态下，全血中含有红、白细胞二类，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核无分裂能力；白细胞虽有细胞核存在，但是在外周血中已处于休止期（G0），因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。现在最常用的促使分裂的药品是植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA），它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞，这就为染色体的制备创造了条件。在 PHA 的作用下，处在 G0 期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至 70 h 左右时，大多数淋巴细胞己处于第二增殖周期内，此时用秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在

2 分裂的细胞都停止在中期，再经低渗处理、固定、染色，获取的中期分裂相细胞。染色体标本，可在显微镜下拍照进行核型分析，或用计算机进行图像分析。二、实验过程（一）器械超净工作台、酒精灯、5m1 无菌注射器、5 号针头、10ml 培养瓶、橡皮塞、 75％酒精棉球、水平式离心机、定时钟、试管架、量筒、10ml 刻度离心管、冰玻片，毛细滴管、恒温水浴箱、恒温培养箱、托盘天平、光学显微镜。（二）试剂 RPMI1640、小牛血清、肝素(500U/ml)、秋水仙素(5μg/ml)、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为 3∶1，现用现配）、0.075mol.L-1KCI 低渗液、 Giemsa 染液、pH6.8 磷酸缓冲液、5％NaHCO3。三、主要步骤（一）采血与接种用一次性 5ml 注射器取 500U/ml 的肝素 0.2-0.3ml 湿润针筒后，然后将多余的肝素排除。常规消毒被检者肘部皮肤，从肘部静脉采血 2ml。转动针筒以混匀肝素；随后在超净工作台中将血液滴入盛有 5ml 培养液（4ml RPMI l640、lml 小牛血清，0.2ml PHA，用 5％的 NaHCO3 调 pH 至 7.0～7.4）的培养瓶内，每瓶 0.3～ 0.5ml（7 号针头约 20 滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。（二）培养 1. 将培养瓶放在 37℃恒温箱内培养 72h。 2. 在终止培养前 2h，将 5μg/ml 的秋水仙素 1～2 滴（5 号针头）加入培养瓶内（终浓度为 0.07μg/ml），轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养 2h。（三）染色体标本的制备（胰蛋白酶法） 1. 收获细胞用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入 10ml 刻度离心管内，平衡后放入离心机内，离心 8～10min（1000r/min），弃上清液。 2. 低渗处理加 8ml 预温（370C）的 0.075mol.L-1KCI 低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放在 37℃恒温水浴锅中，静置 15～20min，使白细胞膨胀，染色体分散（精确的低渗时间应自行摸索）。 3.固定（1）预固定：低渗处理完成后，加入现配制固定液 1ml，吹打均匀。1000 r/min

3 离心 8～10min，弃去上清液。（2）固定：沿离心管壁加入新配固定液 8ml 打匀， 1000 r/min 再离心 8～ 10min，弃去上清液。（3）再固定：再加入新配固定液 8ml，打匀（静置 30min），1000 r//min 离心 8～10min，弃去上清液。 4. 制片视细胞多少，加入适量新配固定液制成细胞悬液，将细胞悬液 2-3 滴，滴到清洁的冰玻片上，在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干。 5. 染色晾干的标本用 Giemsa 染液（Giemsa 原液∶pH6.8 磷酸缓冲液为 1∶9）染色 8～10min、自来水冲洗、晾干。（四）镜检将制备好的染色体玻片放置到显微镜下，先用低倍镜找到分散良好的分裂相，然后后换高倍镜、油镜、认真观察。四、注意事项 1．PHA 是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用 200~300μg/ml，每毫升培养液加 0.2～0.3ml，浓度过高可能会导致红细胞凝集。 2．秋水仙素浓度与处理时间，一般最终浓度以 0.05μg/ml 为宜，处理时间为 2 小时。如果浓度太低，处理时间太短，则分裂相少；浓度太高，处理时间太长，则分裂相虽多，但因染色体缩得太短而形态特征模糊。 3．培养温度应严格控制在 37℃+0.5℃。 4．双蒸水 pH 值应在 6-7 之间。 5．低渗一步极为重要，关系到染色体分散的好坏，因此低渗液的浓度与低渗的时间应掌握好。 6．离心速度不宜过高，速度太高细胞团不易打散，反之，分裂相易丢失。 7．固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底吹匀，若吹打不够则细胞在玻片上成堆，反之则细胞易碎，以至染色体数目不完整。 8．培养液的 pH 值应掌握在 7.0~7.2 左右，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞出现轻度固缩。 9．玻璃器皿要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯的为好

10.无菌操作过程应保持高度无菌概念,严防细菌和病毒污染。在外周血培养过程中,HHA对淋巴细胞的刺激效应个体差异较大,同样方法和条件,分裂相多少及分散情况可各不相同。第二节染色体G显带技术染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的,它能显示染色体本身更细微的结构。自20世纪60年代末以来,染色体显带技术得到了很大的发展这一技术的应用,可以准确识别23对不同类型的染色体,并能识别同一号染色体上的不同区带。从而提髙了染色体核型分析的精确度,为临床上某些疾病的诊断提供了更有效的手段。显带染色体是染色体标本经过一定程序处理,并用特定染料染色,使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的带纹,称为染色体带,这种染色体显带的技术, 称为显带技术。通过显带技术,使各号染色体都显现出独特的带纹,这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定,不同对染色体的带型不同。20世纪70年代以来,显带技术得到了很大发展,在众多的显带(Q带、G 带、C带、R带、T带)技术中,G带是目前应用最广泛的一种带型。因为它主要是被 Giemsa染料染色后而显带,故称之为G显带技术。因其方法简便,带纹清晰,染色体标本可以长期保存,而被广泛用于染色体病的诊断和硏究。一套单倍体染色体带纹数有320条带。70年代后期,由于技术的改进,可以从早中期、前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显示550~850条或更多的带纹称为高分辨显带染色体( high resolution band ing chromosome,HRBC)。、显色原理关于G带的形成机理,迄今尚不十分清楚。有人认为,在胰蛋白酶的作用下, 蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后,这些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域,由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为,染色体经蛋白酶消化后,染色体的核蛋白破坏,这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为,染色体上TA和C-G碱基

4 10．无菌操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染。 11．在外周血培养过程中，PHA 对淋巴细胞的刺激效应个体差异较大，同样方法和条件，分裂相多少及分散情况可各不相同。第二节染色体 G 显带技术染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构。自 20 世纪 60 年代末以来，染色体显带技术得到了很大的发展。这一技术的应用，可以准确识别 23 对不同类型的染色体，并能识别同一号染色体上的不同区带。从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了更有效的手段。显带染色体是染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的带纹，称为染色体带，这种染色体显带的技术，称为显带技术。通过显带技术，使各号染色体都显现出独特的带纹，这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型不同。20 世纪 70 年代以来，显带技术得到了很大发展，在众多的显带（Q 带、G 带、C 带、R 带、T 带）技术中，G 带是目前应用最广泛的一种带型。因为它主要是被 Giemsa 染料染色后而显带，故称之为 G 显带技术。因其方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，而被广泛用于染色体病的诊断和研究。一套单倍体染色体带纹数有 320 条带。70 年代后期，由于技术的改进，可以从早中期、前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显示 550～850 条或更多的带纹,称为高分辨显带染色体（high resolution banding chromosome，HRBC）。一、显色原理关于 G 带的形成机理，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰蛋白酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是 G 带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和 DNA 结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的 DNA 分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上 T—A 和 C—G 碱基

5 的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。A—T 碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而 G—C 碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。总之，目前说法较多，主要概括为三种观点，即显带是由于:①DNA 的作用；②蛋白质的作用；③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用 Giemsa 染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的 G 带。 G 显带制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观察。故已成为研究分析染色体的主要常规方法之一。二、实验用品和材料（一）器械普通光学显微镜、37℃恒温水浴箱、立式染色缸、刻度吸管、橡皮吸头、pH 试纸。（二）试剂 2.5%胰蛋白酶原液、0.25%的胰蛋白酶工作液、生理盐水、Giemsa 原液、 Giemsa 工作液、1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 4.0～4.5）。三、基本步骤（胰蛋白酶法） 1．将常规制备的人染色体玻片标本（未染色的白片）置于 70℃烤箱中处理 2 h，然后转入 37℃培养箱中备用，一般在第 3～7 天进行显带。 2．取 0.25%胰蛋白酶溶液 5 ml，倒入染色缸中，加入 45 ml 生理盐水，用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 及酚红调节胰蛋白酶溶液 pH 6.8～7.2。 3．将配好的胰蛋白酶工作液放入 37℃恒温水浴箱中预温。 4．将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理 1～2 min（精确的时间需自行摸索）。 5．立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗 2 次。 6．将标本浸入 37℃预温的 Giemsa 工作液（Giemsa 原液和 pH 6.8 的磷酸缓冲液比例为 1:9）中染色 10 min 左右。 7．自来水冲洗（用细水小心冲洗），空气晾干