第四章基因 诊断技术与方 法(下) 2聚合酶链反应 1985年由美国 Cetus公司 的 Kary mullis首创了一种极为 简便和快速地能在体外进行扩 增DNA的技术,在很短时间内, 数量上仅几个拷贝的基因可放 大上百万倍,极大地提高了 DNA扩增率,这就是聚合酶链 反应( polymerase chain reaction, PCR), Mullis因此获得了1993 年诺贝尔医学奖。现在,PCR 已成为基因诊断技术中普遍应 用的技术。 2.1聚合酶链反应的基本 原理 PCR实际上是以DNA为模 板,在4种核苷酸存在的条件 下,借DNA聚合酶的作用而产 生的酶促合成反应。PCR反应 最重要的组分是引物,也就是从 模板DNA双链选取一段特定序 列再在体外合成的寡核酸链。 PCR之所以能够发生,依赖于 在加热条件下,双链DNA解离 形成单链(变性),当温度骤然 降低(复性)时,在反应环境中 的引物能特异地与这些单链相 结合,同时使4种核苷酸在 DNA聚合酶的作用下,发生以
第四章 基因 诊断技术与方 法（下） 2 聚合酶链反应 1985 年由美国 Cetus 公司 的 Kary Mullis 首创了一种极为 简便和快速地能在体外进行扩 增 DNA 的技术，在很短时间内， 数量上仅几个拷贝的基因可放 大上百万倍，极大地提高了 DNA 扩增率，这就是聚合酶链 反应(polymerase chain reaction, PCR)，Mullis 因此获得了 1993 年诺贝尔医学奖。现在，PCR 已成为基因诊断技术中普遍应 用的技术。 2.1 聚合酶链反应的基本 原理 PCR实际上是以DNA为模 板，在 4 种核苷酸存在的条件 下，借 DNA 聚合酶的作用而产 生的酶促合成反应。PCR 反应 最重要的组分是引物，也就是从 模板 DNA 双链选取一段特定序 列再在体外合成的寡核酸链。 PCR 之所以能够发生，依赖于 在加热条件下，双链 DNA 解离 形成单链（变性），当温度骤然 降低（复性）时，在反应环境中 的引物能特异地与这些单链相 结合，同时使４种核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下，发生以
引物为起点从5→3端进行聚 合的现象,遂使DNA链不断延 伸 PCR: Polymerase Chain Reaction 30-40 cycles of 3 steps /AA①m ITITTIl I Im mITITTTTIIIllIm1 minut9℃ S m mmIT mTTIT TTMT Step 2: anealing 45 seconds54° 山D八让upmm 2 minutes72°C 八u减 only dNTP's 2.2聚合酶链反应过程 2.2.1PcR基本步骤 ①变性( denaturation):常 规采用94℃,在高温条件下使 模板DNA(待扩增DNA)氢键断 裂,解链成为单链模板:②退 火 annealing):人工合成的两个 寡聚核苷酸引物在较低温度下, 分别与单链模板DNA链形成杂 交链:③延伸( extension):在 72℃条件下,DNA聚合酶将单 核苷酸在引物3'端掺入,沿模 板5→3方向延伸,合成新的 DNA链
引物为起点从 5’→3’端进行聚 合的现象，遂使 DNA 链不断延 伸 2.2 聚合酶链反应过程 2.2.1 PCR 基本步骤 ① 变性(denaturation)：常 规采用 94℃，在高温条件下使 模板 DNA(待扩增 DNA)氢键断 裂，解链成为单链模板；② 退 火(annealing)：人工合成的两个 寡聚核苷酸引物在较低温度下， 分别与单链模板 DNA 链形成杂 交链；③ 延伸(extension)：在 72℃条件下，DNA 聚合酶将单 核苷酸在引物 3’端掺入，沿模 板 5’→3’方向延伸，合成新的 DNA 链
2.2.2PCR条件的要求和 建立 2.2.2.1PCR反应中的主 要成份 模板DNA 引物 aq dna聚合酶 PCR缓冲液 三磷酸脱氧核苷 ( dNTPs)底物 2.2.2.1.1PCR缓冲液 个标准的50~100u1反 应体系应包括: 500. 0mmol/L 100. 0mmol/L Tris·HCl(pH84) MeCl [00.0μgml 明胶或牛血清白蛋白(BSA) 4种单核苷 A(dATP+dCTP+dG TP+dTTP) 各200~250μM 2.2.2.1.1.2PCR缓冲液 PCR缓冲液是PCR扩增的 一种重要因素,尤其是Mg2+
2.2.2 PCR 条件的要求和 建立 2.2.2.1 PCR 反应中的主 要成份 模板 DNA 引物 Taq DNA 聚合酶 PCR 缓冲液 三磷酸脱氧核苷 (dNTPs) 底物 2.2.2.1.1 PCR 缓冲液 一个标准的 50~100μl 反 应体系应包括： 500.0mmol/L KCl 100.0mmol/L Tris·HCl(pH8.4) 1.5mmol/L MgCl2 [100.0μg/ml 明胶或牛血清白蛋白 (BSA)] 4 种单核苷 酸 (dATP+dCTP+dGTP+dTTP) 各 200~250μM 2.2.2.1.1.2 PCR 缓冲液 PCR 缓冲液是 PCR 扩增的 一种重要因素，尤其是 Mg2+
可影响反应的特异性和产率。 Taq dna聚合酶具有Mg2依赖 性,因而PCR反应对Mg2有较 高要求。Mg2浓度低时,Taq酶 活性较低:一般认为在20mM 时,Taq酶具有最大活性;更高 浓度的Mg2对Taq酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低,一个不容忽视的问题就是 Taq酶的活性增高会降低反应 的特异性,因而市售的1aq酶 般都有现成的、含有Mg2的 缓冲液,一般为1.5mM。Mg2 本身又受到很多因素的影响,可 与EDTA或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板DNA 或过量的dNIP时,要相应增加 Mg2浓度。现在又有一种新的 观点,即退火温度越高,Mg2+ 浓度应相应增加,已有人将 Mg2浓度增至6mM。 2.2.2.2PCR循环参数 2.2.2.2.1温度和变性 变性失败是最终导致PCR 失败的一个常见原因 PCR反应循环开始,先进 行变性,将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件,一般 采用94℃,2-5分钟。而时间的 长短则由模板和PCR仪来确 定,如模板欠佳或GC含量过 高,应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对Taq酶活性和 dNTP造成损害。Taq酶可以在 这时加入,也可以在最初加好之 后进入PCR循环,即94℃变性 1分钟,退火1分钟和72℃延伸 1分钟,常规进行25~35个循环。 最后,进一步完善PCR反应
可影响反应的特异性和产率。 Taq DNA 聚合酶具有 Mg2+依赖 性，因而 PCR 反应对 Mg2+有较 高要求。Mg2+浓度低时，Taq 酶 活性较低；一般认为在 2.0mM 时，Taq 酶具有最大活性；更高 浓度的 Mg2+对 Taq 酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低，一个不容忽视的问题就是 Taq 酶的活性增高会降低反应 的特异性，因而市售的 Taq 酶 一般都有现成的、含有 Mg2+的 缓冲液，一般为 1.5mM。Mg2+ 本身又受到很多因素的影响，可 与 EDTA 或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板 DNA 或过量的 dNTP 时，要相应增加 Mg2+浓度。现在又有一种新的 观点，即退火温度越高，Mg2+ 浓度应相应增加，已有人将 Mg2+浓度增至 6mM。 2.2.2.2 PCR 循环参数 2.2.2.2.1 温度和变性 变性失败是最终导致 PCR 失败的一个常见原因 PCR 反应循环开始，先进 行变性，将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件，一般 采用 94℃，2~5 分钟。而时间的 长短则由模板和 PCR 仪来确 定，如模板欠佳或 GC 含量过 高，应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对 Taq 酶活性和 dNTP 造成损害。Taq 酶可以在 这时加入，也可以在最初加好之 后进入 PCR 循环，即 94℃变性 1 分钟，退火 1 分钟和 72℃延伸 1分钟，常规进行25~35个循环。 最后，进一步完善 PCR 反应
在72℃延伸10分钟。模板DNA 的复杂程度决定了变性的温度 和时间 2.2.2.2.2温度和复性 引物长度在15~25bp 时,其退火温度 Im=4(G+C)+2(A+D) 可根据AT与GC的个 数,从其交叉点迅速查出较为合 适退火温度 寡核脱氧核苷酸的 (Oligodeoxyribonucleotides)B )3456789101112131415161718192021 3456789012 s0338斜 717375 475154576062656769 737577788081 13424649 55586063656769 5678901 445 12345 2.2.2.2.3温度和延伸 延伸温度常定为72℃,此 时 Taq dna聚合酶活性最高 延伸反应的时间,根据待扩增片
在 72℃延伸 10 分钟。模板 DNA 的复杂程度决定了变性的温度 和时间 2.2.2.2.2 温度和复性 引物长度在 15~25bp 时，其退火温度 Tm=4(G+C)+2(A+T) 可根据 AT 与 GC 的个 数，从其交叉点迅速查出较为合 适退火温度 寡 核 脱 氧 核 苷 酸 的 (Oligodeoxyribonucleotides) 的 Tm (CG)→ 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (AT) ↓ 3 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 4 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 5 56 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 6 53 56 59 62 64 67 69 71 73 75 76 78 80 81 83 84 85 7 50 53 56 60 62 64 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 84 8 47 51 54 57 60 62 65 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 9 44 48 52 55 57 60 63 65 68 70 72 74 75 77 78 80 81 10 41 45 49 53 55 58 61 63 66 68 70 72 74 75 77 78 80 11 39 43 46 50 52 56 59 61 64 66 68 70 72 74 75 77 78 12 40 44 48 51 54 57 60 62 64 66 69 71 72 74 75 77 13 42 46 49 52 55 58 60 63 65 67 69 71 72 74 75 14 43 47 50 53 56 59 61 63 65 67 69 71 73 74 15 44 48 51 54 57 59 61 64 66 68 70 71 73 16 45 49 52 55 57 60 62 64 66 68 70 72 17 47 50 53 56 58 61 63 65 67 69 70 18 48 51 54 57 59 61 63 65 67 69 19 49 52 55 58 60 62 64 66 68 20 50 53 56 58 60 62 64 66 21 51 54 57 59 61 63 65 22 52 55 57 60 62 64 23 53 56 58 60 62 24 54 57 59 61 25 55 58 60 2.2.2.2.3 温度和延伸 延伸温度常定为 72℃，此 时 Taq DNA 聚合酶活性最高。 延伸反应的时间，根据待扩增片