第二章基因诊断 的发展历程 基因诊断的发展历程 基因诊断技术的发展,经历了间接 基因诊断、直接基因诊断、动态基因诊 断三个主要阶段 1间接基因诊断 间接基因诊断是利用遗传标志,推 测某一疾病基因的存在与否,从而辅助 疾病诊断。遗传标志经历了三代发展, 简述如下: 第一代多态性标志:限制性片段长度多 态性(RFLP) restriction fragment length polymorphisms 该技术由 Grodzicker等于1974年创 特定生物类型的基因组DNA经某 种限制性内切酶完全酶解后,会产生分 子量不同的同源等位片段,或称限制性 等位片段。RFLP标记技术的基本原理 就是通过电泳的方法分离和检测这些 片段。凡是可以引起酶解位点变异的突 变,如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA的重新组织(如插入和缺失 造成酶切位点间的长度发生变化)等均 可导致限制性等位片段的变化,从而产 生RFLP
第二章 基因诊断 的发展历程 基因诊断的发展历程 基因诊断技术的发展，经历了间接 基因诊断、直接基因诊断、动态基因诊 断三个主要阶段。 1 间接基因诊断 间接基因诊断是利用遗传标志，推 测某一疾病基因的存在与否，从而辅助 疾病诊断。遗传标志经历了三代发展， 简述如下： 第一代多态性标志：限制性片段长度多 态性（RFLP）restriction fragment length polymorphisms 该技术由Grodzicker等于1974年创 立。 特定生物类型的基因组DNA经某一 种限制性内切酶完全酶解后，会产生分 子量不同的同源等位片段，或称限制性 等位片段。RFLP标记技术的基本原理 就是通过电泳的方法分离和检测这些 片段。凡是可以引起酶解位点变异的突 变，如点突变（新产生和去除酶切位点） 和一段DNA的重新组织（如插入和缺失 造成酶切位点间的长度发生变化）等均 可导致限制性等位片段的变化，从而产 生RFLP
第二代多态性标志 1985年 Jeffreys发现重复序列及其多 态性 VNTR(variable number of tander repeat) 可变数串联重复序列( Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)it 常由二个核甘酸组成的单元如"胞嘧啶 +腺嘌啉"(CA)经过若干次重复组成,由 于重复的次数(即n值)是可变的,因而构 成一种多态类型在非严格定义的情况 下,也称为微卫星重复多态然而VNTR 是从多态自身的结构特点来命名的,而 微卫星重复多态是从此类DNA在梯度 离心分离时所表现的特性提出来 的WNTR是近年提出的概念因其在基 因组中分布极为丰富故应用日趋广泛 就某一WNTR而言通常重复单元可以表 现出几次到几十次不同的重复,并由此 决定不同的长度类型,因而其蕴含的多 态信息量(PIC较大 STR(short tandem repeat) 人类基因组DNA有3×109bp,其 中10%是串联重复序列,称为卫星 DNA。按重复单位的长短,又可分为大 卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中 重复单位仅由26 bases组成的叫微卫 星( microsatellite analysis),又称它 为短串联重复序列( Short Tandem Repeat.STR),STR是存在于人类基 因组DNA中的一类具有长度多态性的 DNA序列,不同数目的核心序列呈串 联重复排列,而呈现出长度多态性,通 常多态性片段长度在100300bp。一般 认为,人类基因组DNA中平均每6 10kb就有一个STR位点,其多态性成 为法医物证检验个人识别和亲子鉴 的丰富来源。不同人体基因组卫星DNA 重复单位的数目是可变的,因此,形 成了极其复杂的等位基因片段长度多 态性
第二代多态性标志： 1985 年Jeffreys 发现重复序列及其多 态性 VNTR(variable number of tandem repeat) 可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat,VNTR)通 常由二个核甘酸组成的单元如"胞嘧啶 +腺嘌啉"(CA)经过若干次重复组成,由 于重复的次数(即n值)是可变的,因而构 成一种多态类型.在非严格定义的情况 下,也称为微卫星重复多态,然而VNTR 是从多态自身的结构特点来命名的,而 微卫星重复多态是从此类DNA在梯度 离心分离时所表现的特性提出来 的.VNTR是近年提出的概念,因其在基 因组中分布极为丰富,故应用日趋广泛. 就某一VNTR而言,通常重复单元可以表 现出几次到几十次不同的重复,并由此 决定不同的长度类型,因而其蕴含的多 态信息量(PIC)较大. STR(short tandem repeat) 人类基因组 DNA 有 3×109bp，其 中 10%是串联重复序列，称为卫星 DNA。按重复单位的长短，又可分为大 卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中 重复单位仅由 2-6bases 组成的叫微卫 星（microsatellite analysis），又称它 为短串联重复序列(Short Tandem Repeat. STR)，STR 是存在于人类基 因组 DNA 中的一类具有长度多态性的 DNA 序列，不同数目的核心序列呈串 联重复排列，而呈现出长度多态性，通 常多态性片段长度在 100-300bp。一般 认为，人类基因组 DNA 中平均每 6～ 10kb 就有一个 STR 位点，其多态性成 为法医物证检验个人识别和亲子鉴定 的丰富来源。不同人体基因组卫星 DNA 重复单位的数目是可变的，因此， 形 成了极其复杂的等位基因片段长度多 态性
第三代多态性标志:单核苷酸多态性 SNP(single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在 基因组水平上由单个核苷酸的变异所 引起的DNA序列多态性 1.1第一代多态性标志 基本步骤: DNA提取→用DNA限制性内切酶 消化 →凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和 位置转移到易操作的滤膜上 →用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜上的 DNA杂交(称 Southern杂交) 放射性自显影或酶学检测显 示出不同材料对该探针的限制性 酶切片段多态性。 例: ECoR I酶切示意图 AG----GAATTC---GAATTC---GAATT C---CG 3 C----CTTAAG---CTTAAG----CTTAA
第三代多态性标志：单核苷酸多态性 SNP(single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在 基因组水平上由单个核苷酸的变异所 引起的DNA序列多态性。 1.1 第一代多态性标志 基本步骤： DNA提取→用DNA限制性内切酶 消化 →凝胶电泳分离限制性片段 →将这些片段按原来的顺序和 位置转移到易操作的滤膜上 →用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜上的 DNA杂交（称 Southern杂交） →放射性自显影或酶学检测显 示出不同材料对该探针的限制性 酶切片段多态性。 例：EcoRⅠ酶切示意图 5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATT C---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAA
--GC5 AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5 AG----GAATTC---GAATCC----GAATT C---CG 3 TC----CTTAAG---CTTAGG---CTTAA G---GC51 AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA CTTAGG----CTTAA G---CG RFLP标记的主要特点: (1)遍布于整个基因组,数量几乎是 无限的 (2)无表型效应,不受发育阶段及器 官特异性限制 (3)共显性,可区分纯合子和杂合子; (4)结果稳定、可靠; (5)DNA需要量大,检测技术繁杂 难以用于大规模的育种实践中。 限制性片段长度多态(RFLP)分析 在人群中,不同个体之间,其DNA碱 基序列存在着DNA多态性。据估计 大约每100~200个碱基中就有一个发 生中性替代而出现多态性。尽管这种多 态性并不引起疾病,但却可影响到限制 酶的切点改变。由于RFLP呈孟德尔式 遗传,因此可用为染色体上疾病基因座 位的遗传标记,通过RFLP的连锁分析, 对疾病进行间接诊断,来推测一个家庭 成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在
G---GC 5’ AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5’ AG----GAATTC---GAATCC----GAATT C---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAGG----CTTAA G---GC 5’ AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAGG----CTTAA G---CG RFLP标记的主要特点： （1）遍布于整个基因组，数量几乎是 无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段及器 官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂， 难以用于大规模的育种实践中。 限制性片段长度多态(RFLP)分析 在人群中，不同个体之间，其 DNA 碱 基序列存在着 DNA 多态性。据估计， 大约每 100～200 个碱基中就有一个发 生中性替代而出现多态性。尽管这种多 态性并不引起疾病，但却可影响到限制 酶的切点改变。由于 RFLP 呈孟德尔式 遗传，因此可用为染色体上疾病基因座 位的遗传标记，通过 RFLP 的连锁分析， 对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭 成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在
20世纪80年代中期已应用这一技术成 功地进行了B地中海贫血病、苯丙酮 尿症等遗传病的基因诊断 RFLP连锁分析是一种十分有用的 遗传病诊断技术,适用于诊断任何一种 单基因遗传病。由于DNA多态性基因 座普遍存在于人体基因组中,即使突变 的遗传病基因序列或基因产物还不清 楚,但只要找到和突变基因连锁的 RFLP基因座,就可以利用RFLP连锁 分析进行遗传病的基因诊断和产前诊 断。有人提出如果建立起一套以20cM 间隔的平均分布于整个基因组的RFLP 基因座,并选用合适的探针,就有可能 对所有的遗传病进行基因诊断。 第一代多态性标志的应用 (1)1978年 YWKan首次利用 RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基 因诊断 Hpaβ珠蛋 白基因片段(kb) Hb基因型 总计 130kb片段的频率 7.67.67.6/7.0 7.013.07.6/13.013.013.0 白人AS51 9 0.31
20 世纪 80 年代中期已应用这一技术成 功地进行了 β 地中海贫血病、苯丙酮 尿症等遗传病的基因诊断。 RFLP 连锁分析是一种十分有用的 遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种 单基因遗传病。由于 DNA 多态性基因 座普遍存在于人体基因组中，即使突变 的遗传病基因序列或基因产物还不清 楚，但只要找到和突变基因连锁的 RFLP 基因座，就可以利用 RFLP 连锁 分析进行遗传病的基因诊断和产前诊 断。有人提出如果建立起一套以 20cM 间隔的平均分布于整个基因组的 RFLP 基因座，并选用合适的探针，就有可能 对所有的遗传病进行基因诊断。 第一代多态性标志的应用 （1） 1978年YW Kan 首次利用 RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基 因诊断 ——————————————— ——————————————— —————————————— Hpa Iβ珠蛋 白基因片段（kb） Hb基因型 ——————————————— ——————— 总 计 13.0kb片段的频率 7.6/7.6 7.6/7.0 7.0/13.0 7.6/13.0 13.0/13.0 ——————————————— ——————————————— —————————————— 白人AS 5 1 1 9 0 16 0.31