第二篇细胞的遗传物质 第一章细胞内核酸的提取 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入,标志着现代医 学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包 括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。 核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础,是重要的生物信息分子,也是 分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动,如种族遗传、生长等有密 切联系;它与生命的异常活动,如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药 物的作用机理等也有密切的关系。因此,核酸是现代生命科学体系中重点研究 的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验 技术中基本的操作之 第一节真核细胞基因组DNA的分离与纯化 DNA主要在细胞核内,核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真 核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多,并且以核蛋白体形式存 在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤 裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是去除体系中的其它 成分,如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸(RNA)等生物大分子的 过程 裂解 细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切 片等方法。为了获得大量完整的DNA,一般采用裂解液等温和的方法破碎细 胞 裂解液一般都含有去污剂(如SDS、 Triton X-100、NP-40、 Tween20等) 和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性,破坏 膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的 作用,一方面提供一个合适的裂解环境(如Tri),另一方面可抑制核酸酶在
1 第二篇 细胞的遗传物质 第一章 细胞内核酸的提取 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医 学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包 括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。 核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是 分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密 切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药 物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究 的课题之一。核酸分为 DNA 和 RNA 两大类。核酸的提取是分子生物学实验 技术中基本的操作之一， 第一节 真核细胞基因组 DNA 的分离与纯化 DNA 主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体 DNA 等。真 核细胞的 DNA 分子比原核生物的 DNA 分子大得多，并且以核蛋白体形式存 在于细胞中。真核细胞基因组 DNA 提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。 裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它 成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的 过程。 一、裂解 细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切 片等方法。为了获得大量完整的 DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细 胞。 裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏 膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的 作用，一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在
裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCI)。裂 解体系中还可以加入蛋白酶:利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸 与蛋白质的分开,便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸 、纯化 根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA提取的实验步骤 (一)材料与设备 试剂消化液(100 mmolL NaCl 10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,25mmol/L EDIA,0.5%SDS,0.1mg/ml蛋白酶K);pH8.0,25 mMo/L EDtA;PBS; TES饱和酚:氯仿:异戊醇;95%乙醇溶液;70%乙醇溶液;TE;0.1%SDS; lpg/ mI rNa酶; 2仪器培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管;刻度吸管;加样器;枪头: 离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱 (二)主要步骤 1如果材料为组织块,可将组织块(约200-1000mg)剪碎后,置入液氮 中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎,每100mg组织加入1,2m消化液 (100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 25mmoI/L EDTA,0. 5%SDS 0.lmg/m蛋白酶K)。 2如果材料是悬浮细胞,收集细胞于微量离心管中,500g×5min离心;如 果材料是贴壁细胞,弃上清后,胰酶消化收集细胞,500g×5min离心。随后用 冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞,500g×5min离心,弃上清,重复一次,并用 倍体积的消化液重悬细胞 3组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中,50℃消化12~18h。 4冷却至4℃,加等体积15mol/LTES饱和酚。 5轻轻振摇,使水相和酚层充分混匀。 6.4℃5000pm~8000rpm离心15min~20min。此时DNA溶液在上层,酚 位于下层,中间是变性蛋白层。 7用吸管小心吸取上层粘稠溶液,移至另一离心管。注意尽量不要带出中 间蛋白层
2 裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂 解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸 与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。 二、纯化 根据 DNA 本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA 提取的实验步骤 （一）材料与设备 1.试剂 消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml 蛋白酶 K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS； TES 饱和酚；氯仿；异戊醇； 95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS； 1μg/ml RNA 酶； 2.仪器 培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头； 离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱 （二）主要步骤 1.如果材料为组织块，可将组织块（约 200~1000mg）剪碎后，置入液氮 中。随后用冰冷的组 织捣碎器捣碎， 每 100mg 组织加入 1.2ml 消化液 （100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS， 0.1mg/ml 蛋白酶 K）。 2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min 离心；如 果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min 离心。随后用 冰冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞，500g×5min 离心，弃上清，重复一次，并用一 倍体积的消化液重悬细胞。 3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化 12～18h。 4.冷却至 4℃，加等体积 15 mo1／L TES 饱和酚。 5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。 6. 4℃5000rpm～8000rpm 离心 15min～20min。此时 DNA 溶液在上层，酚 位于下层，中间是变性蛋白层。 7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中 间蛋白层
8.DNA溶液再加等体积15mol/LTES饱和酚抽提一次,按6、7离心 并吸至另一离心管。 9加等体积氯仿/异戊醇按步骤(5、6)抽提,离心5min 10吸出DNA溶液后,再步骤(9)抽提一次。 1l)用吸管将DNA溶液移至 Eppendorf中,冰浴至0℃ 12加2.5倍体积95%冷乙醇震摇,可见DNA白色沉淀析出 13用75%冷乙醇清洗3~4次 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15加适量TE溶液溶解DNA。 四、结果鉴定 1.紫外分光光度计检测:可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在 260nm时吸光度最大,而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2u1DNA溶解液, 适量稀释,紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值,计算OD260/OD280 比值,比值在1.7-~2.0:1之间,说明DNA纯度可。在260nm处,1OD双链DNA 的浓度为5oμg/ml,据此可计算DNA的浓度(g/ml)=50×(OD260)×稀 释倍数。 2.电泳检测:可检测核酸的完整性和大小。取2μlDNA溶解液与适量上 样缓冲液混合后,经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察,拍照; 如果观察到一条清晰的电泳带,无明显的拖尾,说明DNA完整性好。 第二节真核细胞总RNA的分离提取 RNA是基因表达产物,由以下几类分子组成,TRNA(占细胞总RNA的 80%~85%)、tRNA和核内小分子RNA(占10~15%)、mRNA(占1~5%) 其中mRNA是分子生物学的主要研究对象,分离制备mRNA是克隆基因,分 析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤 真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的 RNA分子,包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶 的污染。RNA酶活性非常稳定,分布广泛,除细胞内源性的RNA酶外,环境 中也存在RNA酶。因此在提取RNA时,应尽量创造一个无RNA酶的环境
3 8. DNA 溶液再加等体积 15 mo1／L TES 饱和酚抽提一次，按 6、7 离心 并吸至另一离心管。 9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心 5min。 10.吸出 DNA 溶液后，再步骤（9）抽提一次。 11.用吸管将 DNA 溶液移至 Eppendorf 中，冰浴至 0℃。 12.加 2.5 倍体积 95%冷乙醇震摇，可见 DNA 白色沉淀析出。 13.用 75%冷乙醇清洗 3～4 次。 14.室温干燥或冷冻干燥 DNA。 15.加适量 TE 溶液溶解 DNA。 四、结果鉴定 1．紫外分光光度计检测：可检测 DNA 的纯度和含量。一般而言核酸在 260nm 时吸光度最大，而蛋白质在 280nm 时吸光度最大。取 2μl DNA 溶解液， 适量稀释，紫外分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，比值在 1.72.0:1 之间，说明 DNA 纯度可。在 260nm 处，1OD 双链 DNA 的浓度为 50g /ml，据此可计算 DNA 的浓度（g /ml）=50×(OD260) × 稀 释倍数。 2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取 2μl DNA 溶解液与适量上 样缓冲液混合后，经 1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照； 如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明 DNA 完整性好。 第二节 真核细胞总 RNA 的分离提取 RNA 是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总 RNA 的 80%～85%）、tRNA 和核内小分子 RNA（占 10～15%）、mRNA（占 1～5%）。 其中 mRNA 是分子生物学的主要研究对象，分离制备 mRNA 是克隆基因，分 析基因表达以及建立 cDNA 文库的首要步骤。 真核细胞总 RNA 分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的 RNA 分子，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的关键是尽量减少 RNA 酶 的污染。RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的 RNA 酶外，环境 中也存在 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境
包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA酶,采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶 RNA提取的关键 真核细胞RNA的提取过程有四个关键点,即①样品(细胞或组织)的有 效破碎;②有效地使核蛋白复合体变性;③对内源RNA酶的有效抑制;④有 效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;其中最关键的是抑制RNA酶活 性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。 二、组织RNA提取的基本步骤 1.仪器:匀浆器、低温离心机、离心管。 2试剂:氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲 醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。 3.主要步骤 (1)取组织50-100mg,加0.8 mI trizol冲洗匀浆器,移入同一离心管, 冰上静置5min (2)加0,2m氯仿,充分震荡混匀,静置3min,4℃,12000g×15min离 心。弃沉淀。 (3)取上清,加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀。一20℃静置2h,4℃, 12000g×10min离心。 (4)弃上清,取沉淀,加入lml75%乙醇溶液,漂洗沉淀,4℃,7500g×5min 离心 (5)弃上清,沉淀真空干燥10min。 (6)加40μ L DEPC溶液,充分溶解RNA 4结果鉴定 (1)紫外分光光度计检测:取RNA溶解液,按一定比例稀释后,紫外 分光光度计测定260mm、280nmOD值,计算OD260OD280比值,如果比值在 17~2.0:1之间,说明RNA纯度可
4 包括去除外源性 RNA 酶的污染和抑制内源性 RNA 酶活性。主要是采用 RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin 和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶。 一、RNA 提取 的关键 真核细胞 RNA 的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有 效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源 RNA 酶的有效抑制；④有 效地将 RNA 从 DNA 和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活 性。提取的 RNA 可以用于核酸杂交、cDNA 合成以及体外翻译等。 二、组织 RNA 提取的基本步骤 1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。 2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC 溶液、1%甲醛变性胶、37%甲 醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA 上样缓冲液。 3.主要步骤 （1）取组织 50~100mg，加 0.8ml Trizol 冲洗匀浆器，移入同一离心管， 冰上静置 5min。 （2）加 0.2ml 氯仿，充分震荡混匀，静置 3min，4℃，12000g×15min 离 心。弃沉淀。 （3）取上清，加入 0.5ml 异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置 2h，4℃， 12000g×10min 离心。 （4）弃上清，取沉淀，加入 1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min 离心。 （5）弃上清，沉淀真空干燥 10min。 （6）加 40μl DEPC 溶液，充分溶解 RNA。 4.结果鉴定 （1）紫外分光光度计检测：取 RNA 溶解液，按一定比例稀释后，紫外 分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，如果比值在 1.72.0：1 之间，说明 RNA 纯度可
标准样品当OD260=1时,RNA浓度约为40μgm1,根据下述公式计算RNA 浓度:RNA浓度(μg/ml)=OD26×稀释倍数×40 (2)电泳检测:1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量,电泳槽及制胶板先 用3%过氧化氢浸泡过夜;制1%甲醛变性凝胶板:4.5μRNA,2ul5×甲醛胶 电泳缓冲液,3.5μ37%甲醛,10ul甲酰胺,离心混匀,65℃变性15min后, 迅速置冰浴中;再加入2山RNA上样缓冲液,离心混匀后上样,6V/cm电压, 电泳1~2h:暗室内紫外光下观察,拍照;如果观察到清晰的18S、28SRNA 电泳带,无大量小分子RNA,说明RNA无明显降解,样品一70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h以上,非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后,经高温(15磅,20min)处理灭活RNA酶,所用试剂均用 DEPC水配制,然后高压处理。 2、实验用水要经DEPC处理,但含Tris的试剂不能用DEPC处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套,以避免RNA酶污染。 第三节质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb~200kb的DNA,存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一,获得大量纯化的质粒 DNA是基因克隆的前提条件。 、碱裂解法提取质粒DNA的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为: 共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH12~125时线性 DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂,经酸中和后,共价闭 合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性,只能聚合成网 状结构,离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA 可用乙醇沉淀出来
5 标准样品当 OD260＝1 时，RNA 浓度约为 40μg/ml，根据下述公式计算 RNA 浓度：RNA 浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。 （2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察 RNA 质量，电泳槽及制胶板先 用 3%过氧化氢浸泡过夜；制 1%甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛胶 电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul 甲酰胺，离心混匀，65℃变性 15min 后， 迅速置冰浴中；再加入 2μl RNA 上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm 电压， 电泳 1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的 18S、28S RNA 电泳带，无大量小分子 RNA，说明 RNA 无明显降解，样品－70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿 160～180℃高温干烤 6h 以上，非耐高温器皿经 0.1% DEPC 液浸泡后，经高温（15 磅，20min）处理灭活 RNA 酶，所用试剂均用 DEPC 水配制，然后高压处理。 2、实验用水要经 DEPC 处理，但含 Tris 的试剂不能用 DEPC 处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免 RNA 酶污染。 第三节 质粒 DNA 的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约 1kb200kb 的 DNA，存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒 DNA 是基因克隆的前提条件。 一、碱裂解法提取质粒 DNA 的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为： 共价闭合环状 DNA 与线性 DNA 的拓扑学性质不同。在 PH1212.5 时,线性 DNA 会完全变性,而共价闭合环状 DNA 只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭 合环状 DNA 可迅速准确的复性。而线性 DNA 不能准确复性，只能聚合成网 状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA 一起沉淀下来。上清液中的质粒 DNA 可用乙醇沉淀出来