第一篇组成人体的细胞 第四章细胞培养 人体是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞 在体内( In vIo)的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外(iνim) 培养进行观察和研究,则要方便得多。活细胞离体后于模拟体内生理环境等特定 的体外条件下,进行孵育培养使之生存并增殖和进行生理活动,这一过程就称为 细胞培养( cell culture)或细胞培养技术( cell culture technique)。 第一节细胞培养概述 、细胞培养的基本概念 细胞培养是从体内组织取出细胞并在体外模拟体内环境下,使之生存、生长、 繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术 体外培养细胞的条件模拟 细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模 拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来,这种人工模拟的生存环境 主要包括营养、温度、渗透压、pH等几方面的因素。 (一)营养需求 体外培养细胞时,营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培 养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。 1.细胞对营养的需求离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同,主 要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。 (1)氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料,也是细胞重要的能量来源,氨基 酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所有的细胞均 需要下列12种氨基酸:精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸 苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。 (2)用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖,其中以葡萄糖最为多 用。糖类物质是细胞最主要的能量来源,同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类
第一篇 组成人体的细胞 第四章 细胞培养 人体是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞 在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro） 培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后于模拟体内生理环境等特定 的体外条件下，进行孵育培养使之生存并增殖和进行生理活动，这一过程就称为 细胞培养（cell culture）或细胞培养技术（cell culture technique）。 第一节 细胞培养概述 一、细胞培养的基本概念 细胞培养是从体内组织取出细胞并在体外模拟体内环境下，使之生存、生长、 繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 二、体外培养细胞的条件模拟 细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模 拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来，这种人工模拟的生存环境 主要包括营养、温度、渗透压、pH 等几方面的因素。 （一）营养需求 体外培养细胞时，营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培 养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。 1．细胞对营养的需求 离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同，主 要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。 （1）氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料，也是细胞重要的能量来源，氨基 酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所有的细胞均 需要下列 12 种氨基酸：精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。 （2）用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最为多 用。糖类物质是细胞最主要的能量来源，同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类
物质重要的碳源。 (3)无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要,同时还对细胞跨膜电 位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离 子主要有钠、钾、镁、磷、钙等 (4)维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶,严重影响着细胞的活力与增 殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B12、吡哆醇等都是培养 基需要添加的成分,尤其以B族的维生素常见 (5)血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰 蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的 血清主要有胎牛血清( fetal bovine serum,FBS)、新生牛血清( newborn calf serum, NCS)、小牛血清( calf serun,CS)、马血清、猪血清以及人血清。 (6)脂肪酸和脂类物质也常有血清提供,尤其被一些特定的细胞系所必需。 例如,用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。 (⑦)微量元素常被添加给那些无血清培养基,以弥补因未添加血清所造成 的微量元素缺失或不足,主要有锌、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代 谢产生的自由基具有重要作用。 2.培养基用于细胞培养的培养基的种类很多,按其物质状态分为半固体 培养基和液体培养基两类;按其来源分为天然培养基和合成培养基。 (1)天然培养基:在细胞培养技术发展的早期,所用的细胞培养基多是来 自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液,常被称为天然培养基。目前最普 遍使用的天然培养基是血清,以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但 这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用,常见的血清添加比例为 5%~20% (2)合成培养基:是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上, 根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂 类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。①基本培养基。早期研制的 合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖,需要添加一定 量的血清才能成为真正的“完全培养基”,故常将其称为基本培养基,常见的 MEM、DMEM、RPMI1640、199等均属此类;②无血清培养基。无血清培养基
物质重要的碳源。 （3）无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要，同时还对细胞跨膜电 位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离 子主要有钠、钾、镁、磷、钙等。 （4）维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶，严重影响着细胞的活力与增 殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B12、吡哆醇等都是培养 基需要添加的成分，尤其以B族的维生素常见。 （5）血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰 蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的 血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum， NCS）、小牛血清（calf serum，CS）、马血清、猪血清以及人血清。 （6）脂肪酸和脂类物质也常有血清提供，尤其被一些特定的细胞系所必需。 例如，用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。 （7）微量元素常被添加给那些无血清培养基，以弥补因未添加血清所造成 的微量元素缺失或不足，主要有锌、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代 谢产生的自由基具有重要作用。 2．培养基 用于细胞培养的培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体 培养基和液体培养基两类；按其来源分为天然培养基和合成培养基。 （1）天然培养基：在细胞培养技术发展的早期，所用的细胞培养基多是来 自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液，常被称为天然培养基。目前最普 遍使用的天然培养基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但 这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用，常见的血清添加比例为 5%～20%。 （2）合成培养基：是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上， 根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂 类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。①基本培养基。早期研制的 合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖，需要添加一定 量的血清才能成为真正的“完全培养基”，故常将其称为基本培养基，常见的 MEM、DMEM、RPMI1640、199 等均属此类；②无血清培养基。无血清培养基
是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。③无 蛋白培养基。目前,这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动 物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的;④限定化学成分培养基。限定化学成 分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基,和无蛋白培养基不同点在于其没有 添加植物水解物,而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此,这种 培养基的所有成分都是明确的,是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基 (二)温度 体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活,不同细胞适宜的培养温 度常由动物种类所决定。比如,哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多 在36℃~37℃;鸟类细胞适宜的培养温度在385℃;昆虫细胞的培养温度在 25℃:冷血脊椎动物的培养温度在18℃~25℃。 培养温度的不适当会严重影响细胞的存活及生长状态。通常,细胞对低温可 有较长时间的忍耐限度,甚至可在低于适宜温度一定范围内生长,但如果培养温 度高于适宜温度时(如在39℃条件下培养人类细胞),细胞常会在几h内便死 亡。因此,定期检查细胞培养箱的温度非常重要。 (三)渗透压 离体的细胞必须生长在等渗的液体环境中才能维持细胞的正常形态结构,并 有助于细胞对出入细胞的物质进行调控。渗透压的大小主要由培养基中各种盐成 分的浓度决定。尽管大多数细胞对渗透压都有一定的耐受性,但适宜的渗透压常 会因细胞的种类及物种来源不同而异。例如,培养人类细胞的理想渗透压为290 mOsm/kg:培养大多数哺乳类动物细胞的理想渗透压多在260 mOsm/kg~320 mOsm/kg范围内;培养小鼠细胞的理想渗透压多在320mOsm/kg左右 (四)气相及pH 体外培养的细胞对气体环境也有一定的要求。多数细胞在培养时需要O2的 存在,但O2的分压多维持在略低于大气中的O2分压的水平,这是因为过高的 O2分压会造成细胞的损伤。CO也是细胞培养所需要的,其与培养基pH值的维 持密切相关,CO浓度的升高会引起培养基pH值降低。体外培养细胞时的气体 环境常由95%的空气和5%的CO2构成,针对培养对象的不同,CO2的浓度常在 2%~10%之间变化
是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。③无 蛋白培养基。目前，这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动 物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的；④限定化学成分培养基。限定化学成 分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基，和无蛋白培养基不同点在于其没有 添加植物水解物，而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此，这种 培养基的所有成分都是明确的，是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基。 （二）温度 体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活，不同细胞适宜的培养温 度常由动物种类所决定。比如，哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多 在 36℃～37℃；鸟类细胞适宜的培养温度在 38.5℃；昆虫细胞的培养温度在 25℃；冷血脊椎动物的培养温度在 18℃～25℃。 培养温度的不适当会严重影响细胞的存活及生长状态。通常，细胞对低温可 有较长时间的忍耐限度，甚至可在低于适宜温度一定范围内生长，但如果培养温 度高于适宜温度时（如在 39℃条件下培养人类细胞），细胞常会在几 h 内便死 亡。因此，定期检查细胞培养箱的温度非常重要。 （三）渗透压 离体的细胞必须生长在等渗的液体环境中才能维持细胞的正常形态结构，并 有助于细胞对出入细胞的物质进行调控。渗透压的大小主要由培养基中各种盐成 分的浓度决定。尽管大多数细胞对渗透压都有一定的耐受性，但适宜的渗透压常 会因细胞的种类及物种来源不同而异。例如，培养人类细胞的理想渗透压为 290 mOsm/kg；培养大多数哺乳类动物细胞的理想渗透压多在 260mOsm/kg～320 mOsm/kg 范围内；培养小鼠细胞的理想渗透压多在 320 mOsm/kg 左右。 （四）气相及 pH 体外培养的细胞对气体环境也有一定的要求。多数细胞在培养时需要 O2 的 存在，但 O2 的分压多维持在略低于大气中的 O2 分压的水平，这是因为过高的 O2 分压会造成细胞的损伤。CO2 也是细胞培养所需要的，其与培养基 pH 值的维 持密切相关，CO2 浓度的升高会引起培养基 pH 值降低。体外培养细胞时的气体 环境常由 95％的空气和 5％的 CO2 构成，针对培养对象的不同，CO2 的浓度常在 2％～10％之间变化
适宜大多数细胞生长的培养基pH多维持在70-74之间,而细胞在培养过程中 所释放出的代谢产物尤其是CO2会造成培养基pH值的迅速下降,很不利于细胞的 继续生长。为了尽可能长时间的将培养基的pH值稳定在适当范围,常借助CO2 一碳酸氢盐缓冲体系或有机缓冲体系(如 HEPES)来解决这一问题。下面的反应 式可以用来说明CO2-碳酸氢盐缓冲体系的作用原理。 Nahco3+H2O←→Na+OH+H2O+CO2↑ 上式说明,只要维持CO2的浓度处于一个相对恒定的状态,上述反应就会 保持平衡,此时培养基中的OH的浓度也就会相对稳定,换言之,培养基的p 也相对恒定。同时,这也是为什么在培养细胞时要维持一定浓度CO2的重要原 因之 (五)无毒无污染 体外培养的细胞必须生长在无毒无污染的环境中,这时因为体外生长的细胞 一般情况下对有毒有害物质无任何解毒能力,抵抗力也极差。细胞毒性物质的存 在常会导致培养细胞的死亡。 除有毒化学物质的污染危害外,细菌等微生物的污染,以及不同细胞间的交 叉污染也是细胞培养时必须要避免的事情。可通过严格的过滤除菌或灭菌处理, 并使用抗生素来降低污染的发生机率。在细胞培养中最常使用的抗生素是青霉素 (常用浓度是25μg/ml~100μg/ml)与链霉素(25μugml~100ugml)。 不同类型细胞间的交叉污染主要由操作不当引起,在对不同细胞进行操作时 应避免使用同一瓶培养基或使用同一个吸管。 第二节培养细胞的生物学特性 、体外培养细胞的分型 体外培养细胞时,主要有两种培养体系:一种是贴附依赖型,一种是悬浮型, (一)贴附依赖型 大多数培养细胞贴附生长,属于贴壁依赖型细胞,依据培养细胞在体外的形 态大致可将其分为以下四种类型。 1.上皮细胞型细胞多呈扁平不规则多角形,中央有圆形细胞核,细胞彼 此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动,处于膜边缘的细胞总与膜相连,很少
适宜大多数细胞生长的培养基pH多维持在7.0-7.4之间，而细胞在培养过程中 所释放出的代谢产物尤其是CO2会造成培养基pH值的迅速下降，很不利于细胞的 继续生长。为了尽可能长时间的将培养基的pH值稳定在适当范围，常借助CO2 －碳酸氢盐缓冲体系或有机缓冲体系（如HEPES）来解决这一问题。下面的反应 式可以用来说明CO2-碳酸氢盐缓冲体系的作用原理。 NaHCO3 + H2O ←→ Na+ + OH- + H2O+CO2↑ 上式说明，只要维持 CO2 的浓度处于一个相对恒定的状态，上述反应就会 保持平衡，此时培养基中的 OH-的浓度也就会相对稳定，换言之，培养基的 pH 也相对恒定。同时，这也是为什么在培养细胞时要维持一定浓度 CO2 的重要原 因之一。 （五）无毒无污染 体外培养的细胞必须生长在无毒无污染的环境中，这时因为体外生长的细胞 一般情况下对有毒有害物质无任何解毒能力，抵抗力也极差。细胞毒性物质的存 在常会导致培养细胞的死亡。 除有毒化学物质的污染危害外，细菌等微生物的污染，以及不同细胞间的交 叉污染也是细胞培养时必须要避免的事情。可通过严格的过滤除菌或灭菌处理， 并使用抗生素来降低污染的发生机率。在细胞培养中最常使用的抗生素是青霉素 （常用浓度是 25µg/ml ～100µg/ml）与链霉素（25μg/ml ～100μg/ml）。 不同类型细胞间的交叉污染主要由操作不当引起，在对不同细胞进行操作时 应避免使用同一瓶培养基或使用同一个吸管。 第二节 培养细胞的生物学特性 一、体外培养细胞的分型 体外培养细胞时，主要有两种培养体系：一种是贴附依赖型，一种是悬浮型。 （一）贴附依赖型 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖型细胞，依据培养细胞在体外的形 态大致可将其分为以下四种类型。 1．上皮细胞型 细胞多呈扁平不规则多角形，中央有圆形细胞核，细胞彼 此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少
单独行动。此型细胞多起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管 上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如,来源于人类胚肾的HEK293细胞,来源于人类 肝脏组织的HEPG2细胞,来源于人类子宫颈的Hela细胞就属此类 2.成纤维细胞型胞体多呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形细胞核, 呈放射状生长。除真正的成纤维细胞外,起源于中胚层间充质的组织的心肌、平 滑肌、成骨细胞、血管内皮等均呈本型形态。另外,也常将一些与成纤维细胞形 态类似的培养细胞归为此类。常见的成纤维性细胞如源自小鼠胚胎的NIH3T3 小鼠结缔组织的L929、中国仓鼠卵巢的CHO、叙利亚地鼠肾脏的BHK21等。 3.游走细胞型多呈散在生长,一般不连成片,具有活跃的游走或变形运 动能力,且方向不确定。此型细胞不稳定,有时难以和其他细胞进行严格区别。 4.多型细胞型一些细胞,如神经细胞由于难以确定其稳定的形态,常归 于此类 (二)悬浮型 有一些类型的细胞在体外培养时不需要贴附,而是悬浮生长。这些细胞的胞 体常呈圆形,多见于一些造血系肿瘤细胞,其特点是生长速度较快、传代方便 常见的U937、HL60、K562造血系肿瘤细胞均属此类 、体外培养细胞与体内细胞的差异 细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间相互作用的影响,生活在缺乏 动态平衡的相对稳定环境中,体外培养的正常细胞已成为一种在特定条件下生长 的细胞群体。它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也出现了一些不 同于机体细胞的性状,主要表现在:①失去原有组织结构和细胞形态。如,体外 培养的肌肉细胞表现出纤维化的特点;②分化减弱或不显,出现类似“返祖”现象 (去分化),细胞的形态功能趋向单一化,或在生存一定时间后衰退死亡;③发 生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系,或变成具有恶 性性状的细胞群 三、培养细胞的生长特点 (一)贴附 大多数哺乳动物细胞在体外生长时需附着在一定底物如塑料、胶原、玻璃或 其他细胞做成的饲养层细胞上才能生长、分裂。贴附之前的细胞一般为球体样
单独行动。此型细胞多起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管 上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如，来源于人类胚肾的 HEK293 细胞，来源于人类 肝脏组织的 HEPG2 细胞，来源于人类子宫颈的 Hela 细胞就属此类。 2．成纤维细胞型 胞体多呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形细胞核， 呈放射状生长。除真正的成纤维细胞外，起源于中胚层间充质的组织的心肌、平 滑肌、成骨细胞、血管内皮等均呈本型形态。另外，也常将一些与成纤维细胞形 态类似的培养细胞归为此类。常见的成纤维性细胞如源自小鼠胚胎的 NIH 3T3、 小鼠结缔组织的 L929、中国仓鼠卵巢的 CHO、叙利亚地鼠肾脏的 BHK-21 等。 3．游走细胞型 多呈散在生长，一般不连成片，具有活跃的游走或变形运 动能力，且方向不确定。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞进行严格区别。 4．多型细胞型 一些细胞，如神经细胞由于难以确定其稳定的形态，常归 于此类。 （二）悬浮型 有一些类型的细胞在体外培养时不需要贴附，而是悬浮生长。这些细胞的胞 体常呈圆形，多见于一些造血系肿瘤细胞，其特点是生长速度较快、传代方便。 常见的 U937 、HL60、K562 造血系肿瘤细胞均属此类。 二、体外培养细胞与体内细胞的差异 细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏 动态平衡的相对稳定环境中，体外培养的正常细胞已成为一种在特定条件下生长 的细胞群体。它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也出现了一些不 同于机体细胞的性状，主要表现在：①失去原有组织结构和细胞形态。如，体外 培养的肌肉细胞表现出纤维化的特点；②分化减弱或不显，出现类似“返祖”现象 （去分化），细胞的形态功能趋向单一化，或在生存一定时间后衰退死亡；③发 生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系，或变成具有恶 性性状的细胞群。 三、培养细胞的生长特点 （一）贴附 大多数哺乳动物细胞在体外生长时需附着在一定底物如塑料、胶原、玻璃或 其他细胞做成的饲养层细胞上才能生长、分裂。贴附之前的细胞一般为球体样