第一篇组成人体的细胞 第三章亚细胞结构的分离与鉴定 细胞由各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组 分,观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一目标的基本手段 般认为,转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机;转速超过25Kr/min,离 心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100 Kr/min, 离心力超过500Kg。 第一节亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆 ( Homogenization)是在低温条件下,将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质(即0.25moL几蔗糖-0.003mol氯化钙溶液)硏磨,使细胞被机械地硏碎 成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过由低速到高速离心技术,使非 均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位,再分部收集, 即可得到各种亚细胞组分。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 是均匀分布于整个离心管中,故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的 颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心 和密度梯度离心 差速离心( differential centrifugation)是在密度均一的介质中由低速到高速 逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺 序依次为:细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与髙尔基体、最后 为核糖体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,一般重复2~3次效果会好
第一篇 组成人体的细胞 第三章 亚细胞结构的分离与鉴定 细胞由各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组 分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一目标的基本手段。一 般认为，转速为10～25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离 心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min， 离心力超过500Kg。 第一节 亚细胞结构分离的技术 分 离 亚 细 胞 组 分 的 第 一 步 是 制 备 组织匀浆 或细胞 匀 浆 。 匀 浆 （Homogenization）是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质（即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液）研磨，使细胞被机械地研碎 成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过由低速到高速离心技术，使非 均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集， 即可得到各种亚细胞组分。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的 颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心 和密度梯度离心。 差速离心（differential centrifugation）是在密度均一的介质中由低速到高速 逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺 序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后 为核糖体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2～3次效果会好
一些。通过差速离心可将细胞器初步分离,但常需进一步通过密度梯离心再行分 离纯化 密度梯度离心( density grad ient centrifugation)是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉 降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介 质要求:能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;pH中性或易调为中性;浓 度大时渗透压不大;对细胞无毒。①速度沉降( veloc ity sedimentation)主要用于 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低,介 质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十 分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离:②等 密度沉降( isopycnic sed imentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器 在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度 相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的 最大密度。再者,这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10-100倍,故往往 需要高速或超速离心,离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不 利。因此,这种方法适于分离细胞器,而不太适于分离和纯化细胞 分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析,以确认。常要 的分析方法包括形态和功能鉴定 第二节细胞核与线粒体的分级分离 、所需试剂及设备 小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光 学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、髙速离心管、滴管、10ml量筒、25m1 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。025moL 蔗糖一0003 moll cacl2溶液、1%甲苯胺兰染液、002%詹纳斯绿B染液、 0.9%NaCl溶液
一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分 离纯化。 密度梯度离心（density gradient centrifugation） 是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉 降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介 质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； pH中性或易调为中性；浓 度大时渗透压不大；对细胞无毒。①速度沉降（velocity sedimentation）主要用于 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介 质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十 分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离；②等 密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器 在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度 相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的 最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10~100倍，故往往 需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不 利。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析，以确认。常要 的分析方法包括形态和功能鉴定。 第二节 细胞核与线粒体的分级分离 一、所需试剂及设备 小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光 学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25m1 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。0.25moL/L 蔗糖一0.003mol/L CaCl2溶液、1%甲苯胺兰染液、0.02%詹纳斯绿B染液、 0.9%NaCl溶液
附溶液的配制: 1/300詹纳斯绿染液: 取詹纳斯绿1克,加 Riger氏液300ml现用现配 1/3000中性红染液: 称取中性红( Neutral red)o.lg,加蒸馏水300ml。室温保存 Ringer solution: Nacl 0 KCI 0.042 CaCl 0.025g 蒸馏水 100m1 0.25mo/L蔗糖一0.003mom氯化钙溶液: 蔗糖 CaCl2 0.33g 蒸馏水 1000ml 、操作步骤 (一)制备肝细胞匀浆 将小白鼠用颈椎脱位法处死,迅速开腹取肝,剪成小块(去除结缔组织)尽快 置于盛有0.9%NaCl的烧杯中,反复洗涤,除去血污,用滤纸吸去表面的液体 称取1g肝组织(湿重)放在小平皿中,用量筒量取8ml预冷的0.25moLL蔗糖一 0003 mol/L CaCI溶液,先加少量该溶液于平皿中,尽量剪碎肝组织后,再全加 入。剪碎的肝组织倒入匀浆管中,使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中,左手持 之,右手将匀浆捣杆垂直插入管中,上下转动研磨3-5次,用8层纱布(先用蔗 糖液湿润)过滤匀浆于离心管中,然后制备涂片①,做好标记,自然干燥。 (二)分级分离与观察 1.细胞核的分离提取与观察
附:溶液的配制： 1/300詹纳斯绿染液： 取詹纳斯绿1克，加Riger氏液300ml。现用现配。 1/3000中性红染液： 称取中性红 (Neutral red)O.1g，加蒸馏水300ml。室温保存. Ringer Solution： NaCl 0.9g KCl 0.042g CaCl2 0.025g 蒸馏水 100m1 0.25mol/L蔗糖一0.003mom/L氯化钙溶液： 蔗糖 85.5g CaCl2 0.33g 蒸馏水 1000ml 二、操作步骤 （一）制备肝细胞匀浆 将小白鼠用颈椎脱位法处死，迅速开腹取肝，剪成小块(去除结缔组织)尽快 置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 称取1g肝组织(湿重)放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25moL/L蔗糖— 0.003mol/L CaCl2溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全加 入。剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持 之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3一5次，用8层纱布 (先用蔗 糖液湿润)过滤匀浆于离心管中，然后制备涂片①，做好标记，自然干燥。 （二）分级分离与观察 1. 细胞核的分离提取与观察
将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机,以2500m,离心15min; 缓缓取上清液,移入高速离心管中,放在冰块中,待分离线粒体用;同时涂一张 上清液片②,做好标记,自然干燥;余下的沉淀物进行下一步骤。 用6m蔗糖一氯化钙溶液悬浮沉淀物,以250Orpm离心l5πin弃上清,将残 留液体用吸管吹打成悬液,滴一滴于干净的载片上,即涂片③,自然干燥。 将涂片①②③用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 2.线粒体的分离提取与观察 将上述装有上清液的高速离心管,从装有冰块的烧杯中取出,配平后,以 17000pm离心20min,弃上清,留取沉淀物。加入0.25moL/蔗糖-0003mo氯 化钙溶液1ml,用吸管吹打成悬液,以17000pm离心20min,将上清吸入另一试 管中,留取沉淀物,加入蔗糖一氯化钙溶液0.lml混匀成悬液(可用牙签)。取上 清液和沉淀悬液,分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④⑤涂片),各滴一滴 0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染色20min 油镜下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。 第三节微粒体的分离 细胞通过匀浆破碎时,细胞质膜碎成片段,这些膜片段的末端融合形成的直 径小于100nm的小泡。来自不同细胞器(细胞核、线粒体、质膜、内质网等) 的小泡有不同的特性,所以可以将这些小泡相互分离。由内膜系统衍生而来的小 膜泡形成相似大小的膜泡异质性集合体,称微粒体( microsome)。分离微粒体的 方法是利用分级离心方法,去掉细胞核、线粒体后,经超速离心法而制备。具体 步骤如下。 1.将体重约为300g饥俄20h后的大鼠断头,取出肝脏,洗涤,剪碎,加2 倍体积的介质溶液(含0.15molL蔗糖,0.025mol/LKCl,0.1 mol/L Tris-HCl pH74, 0.005 mol/L MeCl2),在玻璃匀浆器中匀浆; 2.15000g×10min离心,弃沉淀,取上清 3.10000g×60min离心,弃上清,取沉淀,沉淀即为微粒体; 4.将微粒体保存在介质溶液中
将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15min； 缓缓取上清液，移入高速离心管中，放在冰块中，待分离线粒体用；同时涂一张 上清液片②，做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。 用6m1蔗糖一氯化钙溶液悬浮沉淀物，以250Orpm离心15min弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载片上，即涂片③，自然干燥。 将涂片①②③用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 2. 线粒体的分离提取与观察 将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm离心20min，弃上清，留取沉淀物。加入0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L氯 化钙溶液1m1，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20min，将上清吸入另一试 管中，留取沉淀物，加入蔗糖一氯化钙溶液0.1ml混匀成悬液(可用牙签)。取上 清液和沉淀悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④⑤涂片)，各滴一滴 0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染色20min。 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。 第三节 微粒体的分离 细胞通过匀浆破碎时，细胞质膜碎成片段，这些膜片段的末端融合形成的直 径小于 100nm 的小泡。来自不同细胞器（细胞核、线粒体、质膜、内质网等） 的小泡有不同的特性，所以可以将这些小泡相互分离。由内膜系统衍生而来的小 膜泡形成相似大小的膜泡异质性集合体，称微粒体（microsome）。分离微粒体的 方法是利用分级离心方法，去掉细胞核、线粒体后，经超速离心法而制备。具体 步骤如下。 1. 将体重约为 300g 饥俄 20h 后的大鼠断头，取出肝脏，洗涤，剪碎，加 2 倍体积的介质溶液（含 0.15mol/L 蔗糖，0.025mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl pH7.4, 0.005mol/L MgCl2），在玻璃匀浆器中匀浆； 2. 15000g×10min 离心，弃沉淀，取上清； 3. 100000g×60min 离心，弃上清，取沉淀，沉淀即为微粒体； 4. 将微粒体保存在介质溶液中
第四节溶酶体的分离 溶酶体是由一层单位膜包围,内含多种酸性水解酶的泡状结构。溶酶体含有 40多种水解酶,其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶等。其主要功能是对细 胞内物质的消化作用。此外溶酶体与器官形成、激素分泌的调节以及某些疾病的 发生密切相关。可采用如下方法分离获得。 1制备蔗糖梯度溶液:取带有两个小杯的梯度混合器,两个小杯分别装入 l17m2.lmoL蔗糖和13mll.lmoL的蔗糖; 2将大鼠处死取出肾脏,以1:8(重量/体积)比例加入0.3mol/L蔗糖,然后 在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织 3以150g×10min离心,弃沉淀,取上清液,900g×3min离心,弃上清液, 取沉淀; 4沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层,上层为膜成 分的混合物,中层为线粒体部分,最底层则为半纯化的溶酶体。先用吸管小心吸 掉上层,然后沿管壁加入几毫升0.3mol冮L蔗糖,慢慢摇管使界面层悬浮起来弃 之。用0.3molL蔗糖洗涤1次,底层溶酶体部分悬浮在2.5m0.3mol/蔗糖中; 5将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面,用玻璃棒搅动最上层的梯度 使梯度和溶酶体之间的界面破坏,然后10000150min离心,离心结果可见 梯度溶液分3条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的 溶酶体。以上所有操作需在0~4℃下进行 第五节细胞总蛋白质的分离提取 细胞器是一种动态的结构,如内质网、细胞核和高尔基体等,其蛋白质组成 除了驻留蛋白质之外,还包括穿梭蛋白质和瞬间相互作用的蛋白质。对于这些组 成成分的硏究,即亚细胞蛋白质组研究将有助于对这些蛋白质做全面的挖掘,从 而对细胞器的功能作深入的阐述。蛋白质提取与制备具体操作方法如下: 、材料的选择 早年为了研究的方便,尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质
第四节 溶酶体的分离 溶酶体是由一层单位膜包围，内含多种酸性水解酶的泡状结构。溶酶体含有 40 多种水解酶，其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶等。其主要功能是对细 胞内物质的消化作用。此外溶酶体与器官形成、激素分泌的调节以及某些疾病的 发生密切相关。可采用如下方法分离获得。 1.制备蔗糖梯度溶液：取带有两个小杯的梯度混合器，两个小杯分别装入 117ml 2.1mol/L 蔗糖和 13ml 1.1mol/L 的蔗糖； 2.将大鼠处死取出肾脏，以 1:8（重量/体积）比例加入 0.3mol/L 蔗糖，然后 在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织； 3.以 150g ×10min 离心，弃沉淀，取上清液，9000g×3min 离心，弃上清液， 取沉淀； 4.沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层，上层为膜成 分的混合物，中层为线粒体部分，最底层则为半纯化的溶酶体。先用吸管小心吸 掉上层，然后沿管壁加入几毫升 0.3mol/L 蔗糖，慢慢摇管使界面层悬浮起来弃 之。用 0.3mol/L 蔗糖洗涤 1 次，底层溶酶体部分悬浮在 2.5ml 0.3mol/L 蔗糖中； 5.将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面，用玻璃棒搅动最上层的梯度， 使梯度和溶酶体之间的界面破坏，然后 100000g×150min 离心，离心结果可见： 梯度溶液分 3 条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的 溶酶体。以上所有操作需在 0~4℃下进行。 第五节 细胞总蛋白质的分离提取 细胞器是一种动态的结构，如内质网、细胞核和高尔基体等，其蛋白质组成 除了驻留蛋白质之外，还包括穿梭蛋白质和瞬间相互作用的蛋白质。对于这些组 成成分的研究，即亚细胞蛋白质组研究将有助于对这些蛋白质做全面的挖掘，从 而对细胞器的功能作深入的阐述。蛋白质提取与制备具体操作方法如下： 一、材料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质