第一章基因诊断 的概念 基因诊断的基本概念 基因诊断是以分子杂交技术为基 础,对基因的结构、表达进行静态或动 态的诊断的方法,其可应用于临床,对 某些遗传病、疾病易感性等进行检测 针对这一概念,在本章我们将对分子杂 交技术、分子诊断、静态、动态诊断、 临床监测和预测进行详述。 分子杂交技术 分子杂交( hybridization)技术是分 子生物学中用于检测生物样本中是否 含有特定的生物分子(探针)的一门技 术。两个生物大分子之间由于化学上的 作用,通过化学键结合在一起。利用分 子杂交原理,可由已知分子制备成探针 ( probe),检测另一分子标点 (target)的存 在与否及含量多少。 根据杂交的分子类型,又可分为 DNA-RNA杂交、 DNA-DNA杂交、 RNA-RNA杂交,抗原抗体杂交、蛋白 质-DNA杂交等等 不同的杂交类型包括了不同的技 术,简述常用分子杂交技术如下,详细 的介绍参见第四章基因诊断技术与 方法(上)。 1.1DNA印迹技术( Southern blotting)
第一章 基因诊断 的概念 基因诊断的基本概念 基因诊断是以分子杂交技术为基 础，对基因的结构、表达进行静态或动 态的诊断的方法，其可应用于临床，对 某些遗传病、疾病易感性等进行检测。 针对这一概念，在本章我们将对分子杂 交技术、分子诊断、静态、动态诊断、 临床监测和预测进行详述。 1 分子杂交技术 分子杂交（hybridization）技术是分 子生物学中用于检测生物样本中是否 含有特定的生物分子（探针）的一门技 术。两个生物大分子之间由于化学上的 作用，通过化学键结合在一起。利用分 子杂交原理，可由已知分子制备成探针 (probe)，检测另一分子标点(target)的存 在与否及含量多少。 根据杂交的分子类型，又可分为 DNA-RNA 杂交、DNA-DNA 杂交、 RNA-RNA 杂交，抗原-抗体杂交、蛋白 质-DNA 杂交等等。 不同的杂交类型包括了不同的技 术，简述常用分子杂交技术如下，详细 的介绍参见 第四章 基因诊断技术与 方法（上）。 1.1 DNA 印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬 菌体的分析 是DNA-DNA杂交,在双链DNA 经热变性成为单链状态以后,在适当的 盐浓度和温度的条件下,由于碱基间重 新形成氢键,两条单链DNA又会恢复 成原来的 Watson- Crick型的双链结构。 不同种类的DNA由于链与链之间碱基 排列不同,放在一起因为对应的部分没 有互补的碱基顺序,所以不能形成双链 结构。因此采用适当的方法,鉴定双链 结构的形成可以了解DNA分子间的碱 基顺序的相同程度。 例 限制藤切、转膜与杂交、显影
用于基因组 DNA、重组质粒和噬 菌体的分析。 是 DNA－DNA 杂交，在双链 DNA 经热变性成为单链状态以后，在适当的 盐浓度和温度的条件下，由于碱基间重 新形成氢键，两条单链 DNA 又会恢复 成原来的 Watson- Crick 型的双链结构。 不同种类的 DNA 由于链与链之间碱基 排列不同，放在一起因为对应的部分没 有互补的碱基顺序，所以不能形成双链 结构。因此采用适当的方法，鉴定双链 结构的形成可以了解 DNA 分子间的碱 基顺序的相同程度。 例： 限制酶切、转膜与杂交、显影
DNA 限制酶消化( HindI) 琼脂糖蓰胶电脉 转移至济酸 纤维滤膜上 加贯量 转移缓计液 3P-DNA探针 硝酸紆维滤膜 分子杂交实验 12RNA印迹技术( Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 是DNA一RNA杂交,将具有互补 的碱基对的DNA单链与RNA单链混 合,给与适当的温度条件和盐浓度,则
1.2 RNA 印迹技术 (Northern blotting) 用于 RNA 的定性定量分析。 是 DNA－RNA 杂交，将具有互补 的碱基对的 DNA 单链与 RNA 单链混 合，给与适当的温度条件和盐浓度，则
碱基间形成氢键,如DNA双链一样, 形成DNA一RNA双链。所以,通过用 适当的方法来测定双链的形成,就可以 检查DNA与RNA间碱基排列的相同 性。此外,也可用某基因DNA来分离 和浓缩相对应的mRNA,或相反地用分 离的mRNA以分离对应的基因DNA 1.3蛋白 质的印迹 分析 (Western otter 用于蛋 白质定性定 量及相互作用研究。 与 Southern或 Northern杂交方 似,但 Western blot采用的是聚丙 胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探 针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到 固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。以固相载体上的蛋白质 或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫 反应,再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应,经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测 蛋白水平的表达 三种印迹技术的比较
碱基间形成氢键，如 DNA 双链一样， 形成 DNA－RNA 双链。所以，通过用 适当的方法来测定双链的形成，就可以 检查 DNA 与 RNA 间碱基排列的相同 性。此外，也可用某基因 DNA 来分离 和浓缩相对应的 mRNA，或相反地用分 离的 mRNA 以分离对应的基因 DNA。 1.3 蛋白 质的印迹 分析 (Western blotting) 用于蛋 白质定性定 量及相互作用研究。 与Southern或Northern杂交方法类 似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰 胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探 针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到 固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。以固相载体上的蛋白质 或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫 反应，再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测 蛋白水平的表达。 三种印迹技术的比较
限制性内切酶 RNA样品 蛋白样品 电泳↓转移杂交 转移到MC膜后与 转移到NC膜或尼龙膜转移到膜或PDP 标记探针杂交 后与标记探针杂交 膜后与抗体反应 放或 射化 自学 显显 影色 DNA印迹 RNA印迹 蛋白印迹 1.4其他 斑点印迹( dot blotting) 这是把受检者DNA变性成单链后 直接点样在硝酸纤维膜上,与标记的基 因探针作固相分子杂交,然后根据杂交 结果是否阳性及其阳性强度,来检定基 因是否存在以及基因的数目。这个方法 比较简便快捷,可适于诊断基因缺失的 遗传病。如正常人的细胞中有4个a珠 蛋白基因,根据受检者DNA与32P标
1.4 其他 斑点印迹 (dot blotting) 这是把受检者 DNA 变性成单链后 直接点样在硝酸纤维膜上，与标记的基 因探针作固相分子杂交，然后根据杂交 结果是否阳性及其阳性强度，来检定基 因是否存在以及基因的数目。这个方法 比较简便快捷，可适于诊断基因缺失的 遗传病。如正常人的细胞中有 4 个 α 珠 蛋白基因，根据受检者 DNA 与 32P 标