复旦大学：《细胞与医学遗传学实验》实验内容_细胞的遗传物质_核酸杂交技术

第二篇细胞的遗传物质 第二章核酸杂交技术 自 Southern于1975年创建了检测特异DNA的核酸杂交技术以来, Southern 杂交以及在此基础上发展起来的其它核酸杂交技术已成为分子生物学的基本技 术 核酸杂交( hybrid ization)是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成 异质双链的过程。核酸杂交是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特 定条件下的变性和复性为手段的,对核酸分子进行定性和定量检测的技术。即把 经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定 的膜上,用已知特定序列的标记探针与之杂交,以检验该核酸片段是否与已知的 探针有同源序列。 核酸杂交既可以是DNA与DNA链、RNA与RNA链之间的杂交,又可以是 DNA与RNA链之间的杂交(图2-2-1)。待检核酸既可以是内源的又可以是外源 的,既可以是细胞生物的基因组又可以是质粒和病毒的核酸。探针或是用基因克 隆技术分离获得的特异的DNA序列,或是特异DNA序列在体外转录出的RNA 序列或cDNA序列,或是人工合成的寡核苷酸片段;探针的标记物或是放射性 同位素,或是一些非放射性物质如生物素、地高辛和荧光素等。核酸杂交可进行 染色体图谱分析,测定特异DNA序列的拷贝数(甚至可检测到哺乳动物基因组 中的单拷贝基因),鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记,进行基因克 隆的筛选,检测不同浓度的DNA,鉴别特异基因的表达部位,进行RNA结构的 初步分析、特异RNA的定量检测,分析基因转录的含量变化,末端标记的寡核 苷酸探针可检测点突变,确定有无病毒感染等。 图2-21核酸杂交路线图

第二篇 细胞的遗传物质 第二章 核酸杂交技术 自 Southern 于 1975 年创建了检测特异 DNA 的核酸杂交技术以来，Southern 杂交以及在此基础上发展起来的其它核酸杂交技术已成为分子生物学的基本技 术。 核酸杂交（hybridization）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成 异质双链的过程。核酸杂交是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特 定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。即把 经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定 的膜上，用已知特定序列的标记探针与之杂交，以检验该核酸片段是否与已知的 探针有同源序列。 核酸杂交既可以是 DNA 与 DNA 链、RNA 与 RNA 链之间的杂交，又可以是 DNA 与 RNA 链之间的杂交（图 2-2-1）。待检核酸既可以是内源的又可以是外源 的，既可以是细胞生物的基因组又可以是质粒和病毒的核酸。探针或是用基因克 隆技术分离获得的特异的 DNA 序列，或是特异 DNA 序列在体外转录出的 RNA 序列或 cDNA 序列，或是人工合成的寡核苷酸片段；探针的标记物或是放射性 同位素，或是一些非放射性物质如生物素、地高辛和荧光素等。核酸杂交可进行 染色体图谱分析，测定特异 DNA 序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组 中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克 隆的筛选，检测不同浓度的 DNA，鉴别特异基因的表达部位，进行 RNA 结构的 初步分析、特异 RNA 的定量检测，分析基因转录的含量变化，末端标记的寡核 苷酸探针可检测点突变，确定有无病毒感染等。 图 2-2-1 核酸杂交路线图

第一节核酸探针 、核酸探针的概念 核酸探针是含有标记物的已知特定序列的核酸片段,因为与待检测核酸片段 具有高度同源性而结合,可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具 、探针的种类及选择 根据核酸探针分子性质的不同可分为DNA探针和RNA探针,根据核酸探针 来源的不同又分为基因组DNA探针、人工合成的寡核苷酸探针和cDNA探针。 可以根据实验目的的不同和来源是否经济,选择不同性质或来源的探针。选择探 针时所应遵循的基本原则是核酸探针与待检测核酸片段间要具有髙度同源性。 、探针的标记 核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放 射性同位素标记的核酸探针具有灵敏度髙、特异性强等特点,但因放射性同位素 半衰期短、具放射性污染、成本高等原因,逐渐被非放射性的探针标记物-生物 素、地高辛和荧光素等替代。 (一)标记物的种类 1.放射性标记物放射性同位素是最早使用的核酸探针标记物。可供选择 的用于探针标记的放射性同位素有32P、H、3S、1C、13I、或BI,前三种较常 用。但放射性同位素在探针标记中由于存在放射性污染、半衰期短及在储存、运 输和后期处理上的不便利因素,而逐渐被安全性较高的非放射性标记物所替代 2.非放射性标记物 (1)生物素:生物素是一种生物小分子,可与亲和素( Avidin,Av)发生 特异性的结合,形成生物素亲和素的生物反应放大系统,而用于对标记有生物 素的核酸探针的显示。亲和素是一种碱性的糖蛋白,由四个相同的亚基组成,每 个亚基都可以结合一个生物素分子,这种四价反应产生了放大效应。生物素与亲 和素相互结合的亲和力高、稳定性很好。但亲和素是一种糖蛋白,应用中往往有 较髙的非特异性结合。1963年, Chaiet在从链球菌培养液中筛选抗菌素时发现 了一种能与生物素结合的类亲和素蛋白质-链酶亲和素( Streptavidin,,Sa)。链酶 亲和素与亲和素的结构相似,但不含糖基,因而以链酶亲和素代替亲和素,弥补

第一节 核酸探针 一、核酸探针的概念 核酸探针是含有标记物的已知特定序列的核酸片段，因为与待检测核酸片段 具有高度同源性而结合，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。 二、探针的种类及选择 根据核酸探针分子性质的不同可分为 DNA 探针和 RNA 探针，根据核酸探针 来源的不同又分为基因组 DNA 探针、人工合成的寡核苷酸探针和 cDNA 探针。 可以根据实验目的的不同和来源是否经济，选择不同性质或来源的探针。选择探 针时所应遵循的基本原则是核酸探针与待检测核酸片段间要具有高度同源性。 三、探针的标记 核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放 射性同位素标记的核酸探针具有灵敏度高、特异性强等特点，但因放射性同位素 半衰期短、具放射性污染、成本高等原因，逐渐被非放射性的探针标记物---生物 素、地高辛和荧光素等替代。 （一）标记物的种类 1．放射性标记物 放射性同位素是最早使用的核酸探针标记物。可供选择 的用于探针标记的放射性同位素有 32P、3H、35S、14C、125I、或 131I，前三种较常 用。但放射性同位素在探针标记中由于存在放射性污染、半衰期短及在储存、运 输和后期处理上的不便利因素，而逐渐被安全性较高的非放射性标记物所替代。 2．非放射性标记物 （1）生物素：生物素是一种生物小分子，可与亲和素（Avidin，Av）发生 特异性的结合，形成生物素-亲和素的生物反应放大系统，而用于对标记有生物 素的核酸探针的显示。亲和素是一种碱性的糖蛋白，由四个相同的亚基组成，每 个亚基都可以结合一个生物素分子，这种四价反应产生了放大效应。生物素与亲 和素相互结合的亲和力高、稳定性很好。但亲和素是一种糖蛋白，应用中往往有 较高的非特异性结合。1963 年，Chaiet 在从链球菌培养液中筛选抗菌素时发现 了一种能与生物素结合的类亲和素蛋白质-链酶亲和素（Streptavidin, Sa）。链酶 亲和素与亲和素的结构相似，但不含糖基，因而以链酶亲和素代替亲和素，弥补

了亲和素非特异性结合高的缺点 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性,通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物酶 ( horseradish peroxidase)相互作用,形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 (或荧光素)”连接复合体。之后,通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是,由于生物素普遍存在于 生物体内,因此在 Souther、 Northern和原位杂交中造成本底升高。另外,生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上,也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点,促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物, (2)地高辛:地高辛( digoxigenin,Dig)是一种类固醇半抗原分子,可以通过 连接臂被人工连接于dUTP上,如形成Dg- 11-dUTP,在酶学反应中可代替 dTTP掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛,所以相对来说, 以地高辛标记的探针在 Southern、 Northern和原位杂交中本底较低,它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体,可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测,如使报道酶发生水解生色或化学发光反 (3)荧光素:核酸探针可以直接用荧光素( fluorecein)标记,如罗丹明或FITC。 荧光素标记的探针系统,使用的是荧光素-12-dUTP或荧光素-12-UTP(也有用荧 光素-ll-dUTP或荧光素-11UTP)代替dTPP或TP在酶学反应中掺入到探针中 去,然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物 酶( horserad ish peroxidase)的抗荧光素抗体检测。 (二)探针标记的方法 总体看来,核酸探针标记的方法有两大类:酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上,常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物一连接有硝基苯叠氮的生物素一光敏生物素在UV 或强可见光(350nm)照射激发下,形成的一个芳香硝基中间化合物(氮宾)可 以非特异性地与DNA或RNA形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中,这样,标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质

了亲和素非特异性结合高的缺点。 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性，通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase）相互作用，形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 （或荧光素）”连接复合体。之后，通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是，由于生物素普遍存在于 生物体内，因此在 Southern、Northern 和原位杂交中造成本底升高。另外，生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上，也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点，促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物。 （2）地高辛：地高辛(digoxigenin, Dig)是一种类固醇半抗原分子，可以通过 一连接臂被人工连接于 dUTP 上，如形成 Dig-11-dUTP，在酶学反应中可代替 dTTP 掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛，所以相对来说， 以地高辛标记的探针在 Southern、Northern 和原位杂交中本底较低，它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体，可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测，如使报道酶发生水解生色或化学发光反 应。 （3）荧光素：核酸探针可以直接用荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或 FITC。 荧光素标记的探针系统，使用的是荧光素-12-dUTP 或荧光素-12-UTP（也有用荧 光素-11-dUTP 或荧光素-11-UTP）代替 dTTP 或 TTP 在酶学反应中掺入到探针中 去，然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase）的抗荧光素抗体检测。 （二）探针标记的方法 总体看来，核酸探针标记的方法有两大类：酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上，常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR 末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物—连接有硝基苯叠氮的生物素—光敏生物素在 UV 或强可见光（350nm）照射激发下，形成的一个芳香硝基中间化合物（氮宾）可 以非特异性地与 DNA 或 RNA 形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中，这样，标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质

所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每200个左右核苷酸才带有 个生物素残基,所以不会影响探针与靶核酸的杂交,足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern杂交中检测出单拷贝序列。相比之下,光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法,另外,光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多,所以,在进行探针标记时,人们首选的是酶学标记法 四、探针的纯化 般情况下,用于杂交的核酸探针在制备完成后,可直接用于进行杂交实验 但如果探针过长的话(>25nt),在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成,对于某些探针精度要求较高的实验,需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern杂交技术 Southern杂交的概念 Southern杂交技术是将凝胶电泳分离的酶切DNA片段通过印记法 ( Imprinting)转移到硝酸纤维素膜上,检测标记过的探针是否与变性后的DNA 发生杂交,而对靶DNA进行定性和定量的一项分子生物学技术,包括DNA的 印记转移和DNA的杂交两部分内容。 、 Southern杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组DNA,并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组DNA,消化后所得的DNA片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离,再对DNA进行原位变性,以印记法将DNA片段从胶上转移至固相支持物 上(如尼龙膜或硝酸纤维素膜)(图2-2-2),用标记的DNA或RNA探针在膜上 与转印后的DNA片段杂交,最后,针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶DNA 的存在及位置(图2-2-3)。 图2-2-2印记转移 图2-2-3 Southern杂交路线图

所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每 200 个左右核苷酸才带有一 个生物素残基，所以不会影响探针与靶核酸的杂交，足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern 杂交中检测出单拷贝序列。相比之下，光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法，另外，光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多，所以，在进行探针标记时，人们首选的是酶学标记法。 四、探针的纯化 一般情况下，用于杂交的核酸探针在制备完成后，可直接用于进行杂交实验。 但如果探针过长的话（＞25nt），在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成，对于某些探针精度要求较高的实验，需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern 杂交技术 一、Southern 杂交的概念 Southern 杂交 技术 是将 凝胶 电泳 分离 的酶 切 DNA 片段通 过印 记法 （imprinting）转移到硝酸纤维素膜上，检测标记过的探针是否与变性后的 DNA 发生杂交，而对靶 DNA 进行定性和定量的一项分子生物学技术，包括 DNA 的 印记转移和 DNA 的杂交两部分内容。 二、Southern 杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组 DNA，并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组 DNA，消化后所得的 DNA 片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离，再对 DNA 进行原位变性，以印记法将 DNA 片段从胶上转移至固相支持物 上（如尼龙膜或硝酸纤维素膜）（图 2-2-2），用标记的 DNA 或 RNA 探针在膜上 与转印后的 DNA 片段杂交，最后，针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶 DNA 的存在及位置（图 2-2-3）。 图 2-2-2 印记转移 图 2-2-3 Southern 杂交路线图

三、 Southern杂交的实验步骤 (一)材料与设备 1. PBS: 0.137 mol/L NaCI 2.68 mmol/L KCl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4(pH7.2) 2.STEL缓冲液:0.2%SDS 10 mmol/L Tris-HCI (pH7.5) 10 mmol/L EDta 100 mmol/L LiCl 3. 5 mol/L LiCI T缓冲液:10 mmol/L Tris-HCI(80) I mmolL EDTA(8.0) 5.限制酶高盐缓冲液(1×):100 mmol/L NaCl 50 mmol/L Tris-HCI(7.5) O mmolL MgCl 1 mmol/L DTT 6.限制酶中盐缓冲液(1×):50 mmol/L NaCI 10 mmol/L Tris-HCI (7.5) 10 mmol/L MgClz I mmol/L Dtt 限制酶低盐缓冲液(1×):10mmo/ L Tris-HCI(75) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L dtt 8.牛血清白蛋白:1 mg/ml 9.限制性内切酶 10.上样液(6×):0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF

三、Southern 杂交的实验步骤： （一）材料与设备 1．PBS：0.137 mol/L NaCl 2.68 mmol/L KCl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4 (pH 7.2) 2．STEL 缓冲液：0.2% SDS 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5) 10 mmol/L EDTA 100 mmol/L LiCl 3．5 mol/L LiCl 4．TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (8.0) 1 mmol/L EDTA (8.0) 5．限制酶高盐缓冲液（1×）：100 mmol/L NaCl 50 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 6．限制酶中盐缓冲液（1×）：50 mmol/L NaCl 10 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 7．限制酶低盐缓冲液（1×）：10 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 8．牛血清白蛋白：1 mg/ml 9．限制性内切酶 10．上样液（6×）：0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯氰 FF