1、上升镜筒，取下载片。 2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残 留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。 4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时 把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告 （一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明 放大倍数。 （二）思考题 1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？ 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、目的与要求 （一）掌握染色的原理和操作过程 （二）掌握简单染色和革兰氏染色法 （三）熟练显微镜的使用技术 二、原理 由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和 背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。 革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴 别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘 液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合 物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复 染成红色，则称革兰氏阴性菌， 三、材料与仪器 （一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花 红）、蒸馏水、菌落培养物（培养 18～24 小时）、二甲苯、香柏油
1、上升镜筒，取下载片。 2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残 留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。 4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时 把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告 （一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明 放大倍数。 （二）思考题 1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？ 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、目的与要求 （一）掌握染色的原理和操作过程 （二）掌握简单染色和革兰氏染色法 （三）熟练显微镜的使用技术 二、原理 由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和 背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。 革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴 别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘 液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合 物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复 染成红色，则称革兰氏阴性菌， 三、材料与仪器 （一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花 红）、蒸馏水、菌落培养物（培养 18～24 小时）、二甲苯、香柏油
（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、 镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（12～16h），大肠杆菌。 四、操作程序 （一）简单染色法 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 1．涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环 以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。 3．固定 涂面朝上，快速通过火焰 2—3 次（勿使涂片烫手）。 4．染色 放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。 6．干燥 自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色 20~30 秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检 1．涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻 混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。 2．干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠 近火焰。 3．固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌 体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲 洗脱落。 4．初染：用草酸铵结晶紫液初染 1min，水洗、吸干。 5．媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染 1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复 合物） 6．脱色：斜置载玻片，用 95%酒精冲洗约 20～30s，立即水洗，吸干。 7．复染：用蕃红花红液复染 1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。 8．镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观 察菌体形态。 （三）革兰氏染色成败的控制点
（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、 镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（12～16h），大肠杆菌。 四、操作程序 （一）简单染色法 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 1．涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环 以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。 3．固定 涂面朝上，快速通过火焰 2—3 次（勿使涂片烫手）。 4．染色 放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。 6．干燥 自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色 20~30 秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检 1．涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻 混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。 2．干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠 近火焰。 3．固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌 体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲 洗脱落。 4．初染：用草酸铵结晶紫液初染 1min，水洗、吸干。 5．媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染 1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复 合物） 6．脱色：斜置载玻片，用 95%酒精冲洗约 20～30s，立即水洗，吸干。 7．复染：用蕃红花红液复染 1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。 8．镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观 察菌体形态。 （三）革兰氏染色成败的控制点
1．涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态， 涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 2．染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结 晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判； 3．乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够， 则阴性菌被误染为阳性菌。 五、实验报告 （一）结果 说明 3 株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。 （二）思考题 1．你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？ 2．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 实验三 酵母菌形态观 察 一、目的与要求 观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。 二、原理 大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁 殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式 以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。 三、材料与仪器 （一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。 （二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。 （三）吕氏美蓝染液。 四、操作步骤 （一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量 酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。 （二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免 产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干
1．涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态， 涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 2．染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结 晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判； 3．乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够， 则阴性菌被误染为阳性菌。 五、实验报告 （一）结果 说明 3 株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。 （二）思考题 1．你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？ 2．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 实验三 酵母菌形态观 察 一、目的与要求 观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。 二、原理 大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁 殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式 以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。 三、材料与仪器 （一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。 （二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。 （三）吕氏美蓝染液。 四、操作步骤 （一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量 酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。 （二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免 产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干
（三）将载玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高低倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 （四）染色约 0.5 小时后再进行观察，注意细胞数量是否增加。 五、实验报告 （一）结果 绘图说明你所观察到的酵母形态特征。 （二）思考题 1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 2．酵母水浸片制作时应注意什么？ 实验四 培养基的制备 一、目的与要求 （一）学习制备培养基的基本技术。 （二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。 二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中 含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体 培养基时须加 2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将 PH 调至中性或微碱性。 牛肉膏蛋白培养基的配方： 牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。 三、材料与仪器 （一）试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 (二)其他 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布， 棉花，牛皮纸，线绳，pH 试纸，电炉，台称。 四、操作步骤 （一）称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小 烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。 （二）溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU 一加入各成分， 使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力， 勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。 （三）调 PH 用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 把 PH 调至所需范围
（三）将载玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高低倍镜观察酵母的形态 和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 （四）染色约 0.5 小时后再进行观察，注意细胞数量是否增加。 五、实验报告 （一）结果 绘图说明你所观察到的酵母形态特征。 （二）思考题 1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 2．酵母水浸片制作时应注意什么？ 实验四 培养基的制备 一、目的与要求 （一）学习制备培养基的基本技术。 （二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。 二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中 含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体 培养基时须加 2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将 PH 调至中性或微碱性。 牛肉膏蛋白培养基的配方： 牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。 三、材料与仪器 （一）试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 (二)其他 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布， 棉花，牛皮纸，线绳，pH 试纸，电炉，台称。 四、操作步骤 （一）称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小 烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。 （二）溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU 一加入各成分， 使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力， 勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。 （三）调 PH 用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 把 PH 调至所需范围
（四）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如 无特殊要求时可省去此步骤。 （五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内， 分装装置如实验图 8 所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染 棉塞引起污染。 1．液体分装 分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜，分装三角瓶的量则根 据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的 1/2 为宜。 2．固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面，斜 面长度不超过管长的 1/2。分装三解瓶，以不超过容积的 1/2 为宜。 3．半固体分装 装置以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 （六）加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞 及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性 能。 （七）包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。 （八）保存 灭菌后的培养基放入 37℃养箱中培养 24 小时，以检验灭菌 的效果，无污染方可使用。 五、实验报告 （一）结果 说明你配制培养基过程中的情况。 （二）思考题 1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？ 实验五 干热灭菌及高压蒸汽灭菌 一、目的与要求 了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、原理 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细 胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含 水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比
（四）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如 无特殊要求时可省去此步骤。 （五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内， 分装装置如实验图 8 所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染 棉塞引起污染。 1．液体分装 分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜，分装三角瓶的量则根 据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的 1/2 为宜。 2．固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面，斜 面长度不超过管长的 1/2。分装三解瓶，以不超过容积的 1/2 为宜。 3．半固体分装 装置以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 （六）加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞 及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性 能。 （七）包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。 （八）保存 灭菌后的培养基放入 37℃养箱中培养 24 小时，以检验灭菌 的效果，无污染方可使用。 五、实验报告 （一）结果 说明你配制培养基过程中的情况。 （二）思考题 1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？ 实验五 干热灭菌及高压蒸汽灭菌 一、目的与要求 了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、原理 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细 胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含 水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比