食品微生物学实验指导 食品微生物学科组 2007.3
食品微生物学实验指导 食品微生物学科组 2007．3 1
实验须知 食品（发酵）微生物学实验的目的是：训练学生掌握最基本的操作技能：了解 微生物学的基本知识：加深对微生物学基本理论的理解。通过实验，培养学生观 察、思考、分析解决实际问题的能力：实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节 约、爱护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，实验时须注意如下事项： 1.为了保证实验室的整洁和实验的顺利进行，非必要的物品和书包，不得 带入室内，实验时不得高声谈话和随意走动。 2.每次实验前要对实验内容进行充分预习，了解实验的目的、原理和方法， 做到心中有数，并作合理安排。 3.实验中要认真观察，及时做好实验记录。对于当时不能得到结果而需要 连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 4.实验操作应严格按操作规程进行，万一遇有带菌物品洒漏、皮肤破伤或 菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醚、丙酮、酒精等易燃药品接近火源，如遇火险， 应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.凡实验用过的菌种以及带有活菌的各种器皿，应先经高压灭菌后才能洗 涤。制片上的活菌标本应先浸泡于3%来苏儿溶液或5%石炭酸溶液中，半小时 以后再行洗刷。如系芽孢杆菌或有孢子的菌，则应适当延长浸泡时间。 7.实验中需进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法
实 验 须 知 食品(发酵)微生物学实验的目的是：训练学生掌握最基本的操作技能；了解 微生物学的基本知识；加深对微生物学基本理论的理解。通过实验，培养学生观 察、思考、分析解决实际问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节 约、爱护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，实验时须注意如下事项： 1．为了保证实验室的整洁和实验的顺利进行，非必要的物品和书包，不得 带入室内，实验时不得高声谈话和随意走动。 2．每次实验前要对实验内容进行充分预习，了解实验的目的、原理和方法， 做到心中有数，并作合理安排。 3．实验中要认真观察，及时做好实验记录。对于当时不能得到结果而需要 连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 4．实验操作应严格按操作规程进行，万一遇有带菌物品洒漏、皮肤破伤或 菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5．实验过程中，切勿使乙醚、丙酮、酒精等易燃药品接近火源，如遇火险， 应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6．凡实验用过的菌种以及带有活菌的各种器皿，应先经高压灭菌后才能洗 涤。制片上的活菌标本应先浸泡于 3％来苏儿溶液或 5％石炭酸溶液中，半小时 以后再行洗刷。如系芽孢杆菌或有孢子的菌，则应适当延长浸泡时间。 7．实验中需进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法。 2
目 录 实验一乳酸菌的分离及初步鉴定 实验二 厌氧菌的培养和滚管技术 实验三 .食品中霉菌及酵母菌的检测 (补充血细胞计数板计数法) 实验四 食品中细菌总数的测定 实验五食品中大肠菌群的检验 实验六.食品中金黄色葡萄球菌的检验 附录一常用染色液的配制 附录二培养基配方 附录三大肠菌群最可能数(MP检索表
目 录 实验一 .乳酸菌的分离及初步鉴定 实验二 .厌氧菌的培养和滚管技术 实验三 .食品中霉菌及酵母菌的检测 （补充血细胞计数板计数法） 实验四 .食品中细菌总数的测定 实验五 .食品中大肠菌群的检验 实验六 .食品中金黄色葡萄球菌的检验 附录一 .常用染色液的配制 附录二 .培养基配方 附录三 .大肠菌群最可能数(MPN)检索表 3
实验一发酵食品中乳酸杆菌的分离和初步鉴别 一、实验目的 学习与掌握食品中乳酸杆菌的常规分离方法并作初步的鉴别。 二、实验原理 乳酸杆菌大多数是发酵工业尤其是食品工业上常用的菌种。乳酸杆茵为厌氧和微好氧 菌，革兰氏染色阳性，表面生菌落较小，可以发酵葡萄糖或乳糖产生乳酸，并将培养基中的 碳酸钙溶解。有些南如保加利亚乳杆菌在15℃时不生长，在45℃甚至50℃时生长，最适生 长温度为40一43℃：而有些前如植物乳杆菌在15℃生长，45℃时一般不生长，最适生长温 度为30℃左右。通常我们利用这些特点可作初步的鉴别。 三、实验材料和仪器 1,酸牛奶1瓶，泡菜汁1管，9ml生理盐水5管，MRS培养基100ml,灭菌CaC03克（用 纸包)。 2.40℃和30℃恒温箱，振荡器，超净工作台，1ml无菌吸管5支，培养皿6套，革兰氏染 色液1套， 四、实验方法与步骤 1.将酸奶和泡莱汁分别制成10倍系列稀释液。 2.取适当稀释度之稀释液0.5或1ml于培养皿中。 3.以无菌操作把无茵CaCO,加入慰化了的MRS培养基中，于自来水中迅速冷却培养基至 45℃左右。轻摇使CC0混均，但不得产生气泡。立即倒入培养皿中，摇匀。 4.待培养基凝周后，倒置放于40℃和30℃恒温箱中培养（酸牛乳样品在40℃下培养：酸泡 菜汁样品在30℃下培养) 5.24或48小时后取出检查。 (1)泡菜汁样品中，菌落周围产生CaC0圈，菌落直径为1~3mm,乳白色偶有浓色 或暗黄色。用接种环挑少许涂片。革兰氏染色镜检为G,菌体大小约0.9一1.2×38μm, 单生，成对或短链。 (2)酸牛奶样品中菌落直径1~3mm,无色素，呈白色至淡灰色。通常菌落表面粗糙 革兰氏染色镜检为G,细胞宽2μm,细胞较长有时呈线形，幼龄培养物中单生或成对。 6.将初步鉴别出的菌落用穿刺法转接到半固体琼脂培养基试管中，同时接种蛋白胨葡萄糖 培养液，分别于40℃和30℃培养24小时后，检查是否产酸，并作革兰氏染色镜检。 五、思考题： 1.在做分离时融化后的培养基为什么要迅速冷却到50℃左右倒平板？ 2.培养基中加入CaCO的目的是什么？
实验一 发酵食品中乳酸杆菌的分离和初步鉴别 一、实验目的 学习与掌握食品中乳酸杆菌的常规分离方法并作初步的鉴别。 二、实验原理 乳酸杆菌大多数是发酵工业尤其是食品工业上常用的菌种。乳酸杆菌为厌氧和微好氧 菌，革兰氏染色阳性，表面生菌落较小，可以发酵葡萄糖或乳糖产生乳酸，并将培养基中的 碳酸钙溶解。有些菌如保加利亚乳杆菌在 15℃时不生长，在 45℃甚至 50℃时生长，最适生 长温度为 40—43℃；而有些菌如植物乳杆菌在 15℃生长，45℃时一般不生长，最适生长温 度为 30℃左右。通常我们利用这些特点可作初步的鉴别。 三、实验材料和仪器 1. 酸牛奶 1 瓶，泡菜汁 1 管，9ml生理盐水 5 管， MRS培养基 100ml，灭菌CaCO3 3 克（用 纸包）。 2. 40℃和 30℃恒温箱，振荡器，超净工作台，1ml 无菌吸管 5 支，培养皿 6 套，革兰氏染 色液 1 套， 四、实验方法与步骤： 1. 将酸奶和泡菜汁分别制成 10 倍系列稀释液。 2. 取适当稀释度之稀释液 0．5 或 1ml 于培养皿中。 3. 以无菌操作把无菌CaCO3 加入融化了的MRS培养基中，于自来水中迅速冷却培养基至 45℃左右。轻摇使CaCO3混均，但不得产生气泡。立即倒入培养皿中，摇匀。 4. 待培养基凝固后，倒置放于 40℃和 30℃恒温箱中培养（酸牛乳样品在 40℃下培养；酸泡 菜汁样品在 30℃下培养） 5. 24 或 48 小时后取出检查。 （1）泡菜汁样品中，菌落周围产生CaCO3圈，菌落直径为 1～3mm，乳白色偶有浓色 或暗黄色。用接种环挑少许涂片。革兰氏染色镜检为G+ ，菌体大小约 0.9～1.2×3～8μm， 单生，成对或短链。 （2）酸牛奶样品中菌落直径 1～3mm，无色素，呈白色至淡灰色。通常菌落表面粗糙， 革兰氏染色镜检为G+ ，细胞宽 2μm，细胞较长有时呈线形，幼龄培养物中单生或成对。 6. 将初步鉴别出的菌落用穿刺法转接到半固体琼脂培养基试管中，同时接种蛋白胨葡萄糖 培养液，分别于 40℃和 30℃培养 24 小时后，检查是否产酸，并作革兰氏染色镜检。 五、思考题： 1. 在做分离时融化后的培养基为什么要迅速冷却到 50℃左右倒平板？ 2. 培养基中加入CaCO3的目的是什么？ 4
实验二厌氧菌的培养和滚管技术 一、 实验目的 了解厌氧微生物的生长特性 2.观察厌氧菌（双歧杆菌）的形态特征 3.掌握滚管分离、培养与计数技术 二、实验原理 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括：厌氧箱培养技术、厌氧罐培养技术 厌氧袋培养技术及亨盖特状氧滚管技术。 亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特(Hungate)于1950年首次提出并应用于 瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断更改进，从 而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术，而且多 年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌氧滚管培养技术不仅可以用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离与活菌培养计 数，还可以用于有害腐败菌如铬酸菌或病原茵如肉毒梭状芽孢杆菌的分离与鉴定。 三、实验材料 1.样品：双歧杆南酸奶、双歧杆南制剂等 2.培养基：改良的MRS培养基、PTYG培养基 3.其他：亨盖特厌氧滚管装置一套、厌氧管、滚管机、定量加样器等 四、实验方法 1.实验流程 铜柱除氧一预还原培养基→稀释液制备→稀释样品→滚管→培养一→计数 2.方法 2.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质石英管或玻璃管。此管的大小为40-400mm 两端被加工成漏斗状，外壁缠绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温 度。铜柱两端连接胶管，一端连接钢瓶，另一端连接出气口。由于从钢瓶出来的气体如 2、CO2、H,等通常都含有一定量的02，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜 和气体中的微量0反应生成氧化铜，铜柱则有明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱 通入H,时，H,与CuO中的氧就结合形成H,0,而CuO又枝还原成铜，铜柱则有呈现明克 的黄色。此时铜柱可以反复使用。 2.2预还原培养基及稀释液的制备 制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养剂和稀释液煮沸去氧，而后用半 定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5-5ml,稀释液装9ml,并 通入氨气排氧，此时可以看到培养基内加入的氧化还原指示剂一刃天青由蓝到红最后变 成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。 23双技杆南样品不同稀释度的制各 在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，加入
实验二 厌氧菌的培养和滚管技术 一、 实验目的 1． 了解厌氧微生物的生长特性 2． 观察厌氧菌（双歧杆菌）的形态特征 3． 掌握滚管分离、培养与计数技术 二、 实验原理 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括：厌氧箱培养技术、厌氧罐培养技术、 厌氧袋培养技术及亨盖特厌氧滚管技术。 亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于 1950 年首次提出并应用于 瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断更改进，从 而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术，而且多 年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌氧滚管培养技术不仅可以用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离与活菌培养计 数，还可以用于有害腐败菌如铬酸菌或病原菌如肉毒梭状芽孢杆菌的分离与鉴定。 三、 实验材料 1． 样品：双歧杆菌酸奶、双歧杆菌制剂等 2． 培养基：改良的 MRS 培养基、PTYG 培养基 3． 其他：亨盖特厌氧滚管装置一套、厌氧管、滚管机、定量加样器等 四、 实验方法 1． 实验流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 2． 方法 2.1 铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质石英管或玻璃管。此管的大小为 40-400mm， 两端被加工成漏斗状，外壁缠绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温 度。铜柱两端连接胶管，一端连接钢瓶，另一端连接出气口。由于从钢瓶出来的气体如 N2、CO2、H2等通常都含有一定量的O2，故当这些气体通过温度约 360℃的铜柱时，铜 和气体中的微量O2反应生成氧化铜，铜柱则有明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱 通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成铜，铜柱则有呈现明亮 的黄色。此时铜柱可以反复使用。 2.2 预还原培养基及稀释液的制备 制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养剂和稀释液煮沸去氧，而后用半 定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装 4.5-5ml，稀释液装 9ml，并 通入氮气排氧，此时可以看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变 成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。 2.3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备 在无菌条件下准确称取 1g固体或用无菌注射器吸取 1ml混合均匀的液体样品，加入 5