酚蓝示踪，电泳（初始电流15mA,稳流25mA),取出胶片，用考马斯亮蓝R2so溶液染色， 脱色至谱带清晰。 结果：苦杏仁有3个特征性主谱带，与桃仁有明显的区别。 2)蕲蛇、乌梢蛇及金钱白花蛇供试品溶液的制备：分取供试品粉末各约1.0g,加 入生理盐水4mL,研磨成匀浆，离心l5min(4000rmin),取上清液，加入1倍量丙酮，离 心15min(4000r/min),加入1/2体积的40%蔗糖液，备用。 电泳方法：吸取上述溶液各20L,分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用溴酚 蓝示踪。电泳（分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为2.5%：初始电流10mA,稳流15mA) 取出胶片，放入7%醋酸溶液中固定10min,用0.2%考马斯亮蓝R250染色30min,取出，用 蒸馏水洗，再放入含20%甲醇和7%醋酸的脱色液中，脱色30mi。 结果：蕲蛇有7条谱带，一级带2条、二级带3条、三级带2条。乌梢蛇有一级带3 条，二级带和三级带各2条，扩散带1条。金钱白花蛇有一级带2条，二级带4条，三级带 2条。 3)小茴香供试品溶液的制备：取小茴香粉末约1.0g,加入25%浓缩胶缓冲液1mL, 超声提取30min,离心20min(3500rmin),吸取上清液，加入40%蔗糖溶液(1：1)，混 匀备用。 易混药材供试溶液的制备：取莳萝子同上法制备。 电泳方法：吸取上述2种溶液各20L,分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用 溴酚蓝示踪，电泳（初始电流15mA,稳流25mA),取出胶片，用考马斯亮蓝R250溶液染 色，脱色至谱带清晰。 结果：供试品与易混品比较，具有4个特征性谱带。 要点及难点解答 (1)经高温或炮制处理的药材，很可能会因蛋白质的失活而难以得到理想的电泳图谱。 (2)新配制的过硫酸铵溶液在4℃下可保存1周。 (3)加蔗糖溶液增加提取液的密度，以便于样品液沉于样品槽底部。 (4)琼脂层既可导电，又具有密封作用。 (5)一定要将水层彻底除去，且注意不能破坏分离胶的水平表面
65 酚蓝示踪，电泳（初始电流 15mA，稳流 25mA），取出胶片，用考马斯亮蓝 R250 溶液染色， 脱色至谱带清晰。 结果：苦杏仁有 3 个特征性主谱带，与桃仁有明显的区别。 2）蕲蛇、乌梢蛇及金钱白花蛇 供试品溶液的制备：分取供试品粉末各约 1.0g，加 入生理盐水 4mL，研磨成匀浆，离心 15min（4 000r/min），取上清液，加入 1 倍量丙酮，离 心 15min（4 000r/min），加入 1/2 体积的 40%蔗糖液，备用。 电泳方法：吸取上述溶液各 20L，分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用溴酚 蓝示踪。电泳（分离胶浓度为 7.5%，浓缩胶浓度为 2.5%；初始电流 10mA，稳流 15mA） 取出胶片，放入 7%醋酸溶液中固定 10min，用 0.2%考马斯亮蓝 R250 染色 30min，取出，用 蒸馏水洗，再放入含 20%甲醇和 7%醋酸的脱色液中，脱色 30min。 结果：蕲蛇有 7 条谱带，一级带 2 条、二级带 3 条、三级带 2 条。乌梢蛇有一级带 3 条，二级带和三级带各 2 条，扩散带 1 条。金钱白花蛇有一级带 2 条，二级带 4 条，三级带 2 条。 3）小茴香 供试品溶液的制备：取小茴香粉末约 1.0g，加入 25%浓缩胶缓冲液 1mL， 超声提取 30min，离心 20min（3 500r/min），吸取上清液，加入 40%蔗糖溶液（1∶1），混 匀备用。 易混药材供试溶液的制备：取莳萝子同上法制备。 电泳方法：吸取上述 2 种溶液各 20μL，分别点样于同一聚丙烯酰胺凝胶胶片上，用 溴酚蓝示踪，电泳（初始电流 15mA，稳流 25mA），取出胶片，用考马斯亮蓝 R250 溶液染 色，脱色至谱带清晰。 结果：供试品与易混品比较，具有 4 个特征性谱带。 要点及难点解答 （1）经高温或炮制处理的药材，很可能会因蛋白质的失活而难以得到理想的电泳图谱。 （2）新配制的过硫酸铵溶液在 4℃下可保存 1 周。 （3）加蔗糖溶液增加提取液的密度，以便于样品液沉于样品槽底部。 （4）琼脂层既可导电，又具有密封作用。 （5）一定要将水层彻底除去，且注意不能破坏分离胶的水平表面
习题与作业 (1)习题 1)用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定中药的实验步骤与方法。 2)常用中药电泳鉴定的主要特征。 (2)作业 记录实验结果并进行分析，绘制各供试品的电泳图谱。 2.3鹿茸的特异PCR鉴定 内容提要 本实验采用中药基因鉴定法中的特异PCR分析原理与技术，对鹿茸的品种或质量进行 鉴定。 通过实验了解生物鉴定法的基本理论、基本方法和基本技术。掌握鹿茸不同品种的特异 PCR鉴定特征和基本方法。 原理 l985美国科学家K.Mullis及同事发明的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, 简称PCR)技术使人们可以在体外轻易地大规模扩增DNA的片段。该技术因此而获得了 1993年的诺贝尔奖。其原理是在试管中以极少量样品DNA作模板，在一对引物的引导下， 通过DNA聚合酶的作用和高温变性、适温复性和延伸的循环往复，在1~2h之内将DNA片 段合成上百万倍。将不同待测药材的DNA片段扩增出来比较其异同，就可以地明确无误地 鉴定药材的分类归属。 基因是物种进化的基础，每种基因在生物一生中都承担其相应的功能，因而，基因的 序列是比较保守的，往往某个基因会在种上表现出变异或进化的特征，特异PC℉鉴定就是 根据这一特点，先对某物种种上群体的特定基因进行序列比对研究，找出序列差异。然后设 计出能特异性的鉴别某个物种的特异引物对，并以此引物对来鉴定供试品。 本实验以不同品种鹿茸为材料分别提取的DNA,并以此作为PCR扩增待检模板，用 6
66 习题与作业 （1）习题 1）用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定中药的实验步骤与方法。 2）常用中药电泳鉴定的主要特征。 （2）作业 记录实验结果并进行分析，绘制各供试品的电泳图谱。 2.3 鹿茸的特异 PCR 鉴定 内容提要 本实验采用中药基因鉴定法中的特异 PCR 分析原理与技术，对鹿茸的品种或质量进行 鉴定。 通过实验了解生物鉴定法的基本理论、基本方法和基本技术。掌握鹿茸不同品种的特异 PCR 鉴定特征和基本方法。 原理 1985 美国科学家 K. Mullis 及同事发明的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， 简称 PCR）技术使人们可以在体外轻易地大规模扩增 DNA 的片段。该技术因此而获得了 1993 年的诺贝尔奖。其原理是在试管中以极少量样品 DNA 作模板，在一对引物的引导下， 通过 DNA 聚合酶的作用和高温变性、适温复性和延伸的循环往复，在 1~2h 之内将 DNA 片 段合成上百万倍。将不同待测药材的 DNA 片段扩增出来比较其异同，就可以地明确无误地 鉴定药材的分类归属。 基因是物种进化的基础，每种基因在生物一生中都承担其相应的功能，因而，基因的 序列是比较保守的，往往某个基因会在种上表现出变异或进化的特征，特异 PCR 鉴定就是 根据这一特点，先对某物种种上群体的特定基因进行序列比对研究，找出序列差异。然后设 计出能特异性的鉴别某个物种的特异引物对，并以此引物对来鉴定供试品。 本实验以不同品种鹿茸为材料分别提取的 DNA，并以此作为 PCR 扩增待检模板，用
已制备的马鹿茸特异引物对供试品模板进行PCR扩增，扩增结果具有特异性。 仪器、材料与试剂 (1)仪器与材料 1)仪器PC℉基因扩增仪，潜水式凝胶电泳仪，紫外光灯，乳钵，微量进样器，离心机， 分析天平，扭力天平，烧杯，量筒，三角瓶，刻度吸管(1mL,2mL,10mL),试管，离心 管，培养皿，滤纸等。 2)材料马鹿茸，花鹿茸。任选其他鹿茸DNA。 (2)试剂Taq酶(0.9U),10 nM/LdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP),50mML马 鹿特异PCR引物对(primerl:5'GTTATGTAAACAAGACTGTTCGCCAGAGTACTACC GGC3',primer2:5 TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT3'),1.4%琼脂糖，溴 化乙锭(EB),25 nM/L MgCl2,10 X Buffer(缓冲溶液)，ddHO,液氮，1×TAE电泳缓 冲液等。 操作步骤 (1)模板的制备取马鹿茸约03g,用刀片刮去表面层，无菌水清洗若干次，晾干， 置洁净的乳钵内，加液氮研磨至细粉末，移入10mL的离心管中，用SDS(十二烷基硫酸钠) 法提取DNA,作为供试品模板。同法制备梅花鹿茸的DNA,作为对比品模板。 (2)引物的选择马鹿茸的特异PCR引物对。 (3)PCR扩增反应体系50uL反应体系（表），实验设1个DNA空白对照。 表 PCR扩增反应体系 1个反应 n个反应 10X Buffer 5uL Xn MgCl2 3uL Xn dNTP 1uL Xn primer1/primer2 各0.2uL Xn DNA 2u(约30ng) Xn Taq酶 0.3uL ×n ddH2O 38.3uL Xn 61
67 已制备的马鹿茸特异引物对供试品模板进行 PCR 扩增，扩增结果具有特异性。 仪器、材料与试剂 (1)仪器与材料 1)仪器 PCR 基因扩增仪，潜水式凝胶电泳仪，紫外光灯，乳钵，微量进样器，离心机， 分析天平，扭力天平，烧杯，量筒，三角瓶，刻度吸管（1mL，2mL，10mL），试管，离心 管，培养皿，滤纸等。 2)材料 马鹿茸，花鹿茸。任选其他鹿茸 DNA。 （2）试剂 Taq 酶(0.9U)，10mM/L dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），50mM/L 马 鹿特异 PCR 引物对（primer1： 5′GTTATGTAAACAAGACTGTTCGCCAGAGTACTACC GGC3′, primer2： 5′TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT3′），1.4％琼脂糖，溴 化乙锭（EB），25mM/L MgCl2，10×Buffer（缓冲溶液），ddH2O，液氮 ，1×TAE 电泳缓 冲液等。 操作步骤 （1）模板的制备 取马鹿茸约 0.3g，用刀片刮去表面层，无菌水清洗若干次，晾干， 置洁净的乳钵内，加液氮研磨至细粉末，移入 10mL 的离心管中，用 SDS(十二烷基硫酸钠) 法提取 DNA，作为供试品模板。同法制备梅花鹿茸的 DNA，作为对比品模板。 （2）引物的选择 马鹿茸的特异 PCR 引物对。 （3）PCR 扩增反应体系 50uL 反应体系（表 ），实验设 1 个 DNA 空白对照。 表 PCR 扩增反应体系 1 个反应 n 个反应 10×Buffer 5uL ×n MgCl2 3uL ×n dNTP 1uL ×n primer1/primer2 各 0.2uL ×n DNA 2uL(约 30ng) ×n Taq 酶 0.3uL ×n ddH2O 38.3uL ×n