总糖(%)。查曲线所得水解后还职糖毫克数稀释倍数0910 样品毫克数 六、附注 1.离心时对称位置的离心管必须配平。 2。标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 3.面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。 七、思考题 1.3,5二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的？ 2.如何正确绘制和使用标准曲线？ 参考答案 1.植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原 性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性 条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基5- 基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分 光光度计，在540m波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和 总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算 多糖含量时应垂以09 2.标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm,标示出刻度和葡萄 糖的毫克数：纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm,标示刻度和光密度值：曲线为过原点的直 线，测定点均匀分布在直线的两侧：标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确 定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线：测定数据不应 记在标准曲线上。 (任大明)
6 六、附 注 1． 离心时对称位置的离心管必须配平。 2． 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 3． 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。 七、思考题 1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2．如何正确绘制和使用标准曲线? 参考答案 1．植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原 性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性 条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝 基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分 光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和 总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算 多糖含量时应乘以 0.9。 2．标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边 1.5~2cm，标示出刻度和葡萄 糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边 1.5~2cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直 线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确 定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应 记在标准曲线上。 （任大明） 查曲线所得水解后还原糖毫克数 稀释倍数 总糖（%）= 样品毫克数 0.9 100
实验二还原糖含量测定砷钼酸比色法 一、目的 植物体内的还原触主要是简萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映 植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此 外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉 蔗糖等，经水解也生成还原糖。因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和 测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。 二，原理 还原糖是具有羰基(>C-0)的糖 能将其它物质还原而其本身被氧化 (1)还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为 价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下： CuSO,2NaOH -Naz(SOa)+Cu(OH)2 HO-CH-COONa O-CH-COONa Cu(OH +2H,0 HO-CH-COOK O-CH-COOK CHO H-C-OH Cu -CH-COONa HO-C-H + O-CH-COOK H-C-OH +2H,0 H-C-OH CH2OH COOH 90+2H0- H-COONa +Cu20, HO-CH-COOK (2)氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作 用，生成一种蓝色复合物神钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量（即被还 原的C20量)成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原 糖含量 CuO+H2SO4 Cu' 2Cu+Mo0,2+S0,2→2Cu2+蓝色复合物
7 实验二 还原糖含量测定 砷钼酸比色法 一、目的 植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映 植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此 外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、 蔗糖等，经水解也生成还原糖。因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和 测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。 二，原理； 还原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。 (1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一 价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下： CuSO4 + 2NaOH Na2(SO4) + Cu(OH)2 HO―CH―COONa O―CH―COONa Cu(OH)2 + ∣ u ∣ + 2H2O HO―CH―COOK O―CH―COOK CHO H―C―OH ∣ O―CH―COONa HO―C―H Cu ∣ + ∣ + 2H2O O―CH―COOK H―C―OH ∣ H―C―OH ∣ CH2OH COOH ∣ HO―CH―COONa (CHOH)4 + 2 ∣ + Cu2O↓ ∣ HO―CH―COOK CH2OH （2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作 用，生成一种蓝色复合物 砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量（即被还 原的 Cu2O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原 糖含量。 Cu2O + H2SO4 Cu + 2Cu + + MoO4 2- + SO4 2- 2Cu 2+ + 蓝色复合物
三、实验材料、主要仪器和试剂 1。实验材料 苹果、面粉等 2.主要仪器 (1)分光光度计 (2)水浴锅 (3)具塞刻度试管：20ml10 (4)刻度吸管：1mL1,2ml4,5ml3 (5)容量瓶：100mL2 (6)漏斗 (7)研体 3.试剂 (1)铜试剂： 4%CuS045H,(0 B、称取24g无水碳酸钠，用850mL水溶于大烧杯中，加入2g含4分子结品水的酒 石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠16g,再加入120g无水硫酸钠（加热），全 溶及冷却后加水至900mL,沉淀1~2d,取上清液（要求严格时过滤）备用。 使用前将A与B按1：9混匀即可使用。 (2)钼酸试剂：25g钼酸铵(NH)6M0, ,4H,0溶于450mL蒸馏水中（加热浴 解，但温度接近150℃时易分解)，待冷却后再加入21mL浓HS0,混匀。另将3g砷酸氢 二钠Na,Has047H,O)溶解于25mL蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕 色瓶中可长期使用。 (3)200ug/mL标准简萄糖原液：准确称取分折纯简萄糖200mg,溶解定容到 1000mL. 四、操作步骤 1.标准曲线的制作： 在一系列刻度试管中，分别加入200μg/mL标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 及0.6mL,再顺序加入蒸馏水2、1.9、18、1.7、16、1.5及14mL,配成浓度分别为0、 10、20、30、40、50及60“gmL的系列萄萄糖溶液。每试管加入铜试剂2mL,混匀后沸 水浴中加热10min,立即冷却，再加入2mL砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到20mL,用 分光光度计在620nm波长下比色，测其光密度OD62m(做一式两份)。 以糖浓度微克数为横坐标，光密度OD6om为纵坐标，绘制标准曲线。 2。植物样品中还原糖的提取： 将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取1g放入研钵中，加入约0.5g石英砂 磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗神入1O0mL容量瓶中，加水达70~80mL,摇匀后置于 80C恒温水浴上浸提0.5h
8 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 苹果、面粉等 2．主要仪器 （1）分光光度计 （2）水浴锅 （3）具塞刻度试管：20mL 10 （4）刻度吸管：1 mL 1，2 mL 4，5 mL 3 （5）容量瓶：100 mL 2 （6）漏斗 （7）研钵 3．试剂 （1）铜试剂： A、4％CuSO4 5H2O B、称取 24g 无水碳酸钠，用 850mL 水溶于大烧杯中，加入 2g 含 4 分子结晶水的酒 石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠 16g，再加入 120g 无水硫酸钠（加热），全 溶及冷却后加水至 900mL，沉淀 1～2d，取上清液（要求严格时过滤）备用。 使用前将 A 与 B 按 1∶9 混匀即可使用。 （2）砷钼酸试剂：25g 钼酸铵 (NH4)6Mo7O24 4H2O 溶于 450mL 蒸馏水中（加热溶 解，但温度接近 150℃时易分解），待冷却后再加入 21mL 浓 H2SO4混匀。另将 3g 砷酸氢 二钠(Na2HasO4 7H2O)溶解于 25mL 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕 色瓶中可长期使用。 （3）200μg／mL 标准葡萄糖原液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg，溶解定容到 1000mL。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作： 在一系列刻度试管中，分别加入 200μg／mL 标准葡萄糖 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 及 0.6 mL，再顺序加入蒸馏水 2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及 1.4 mL，配成浓度分别为 0、 10、20、30、40、50 及 60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂 2mL，混匀后沸 水浴中加热 10min，立即冷却，再加入 2mL 砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到 20mL，用 分光光度计在 620nm 波长下比色，测其光密度 OD620nm（做一式两份）。 以糖浓度微克数为横坐标，光密度 OD620nm为纵坐标，绘制标准曲线。 2．植物样品中还原糖的提取： 将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取 1g 放入研钵中，加入约 0.5g 石英砂， 磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗冲入 100mL 容量瓶中，加水达 70～80mL，摇匀后置于 80℃恒温水浴上浸提 0.5h
待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入5%硫酸锌5mL,再慢慢滴入0.3mol/LBa(OH), 5mL,以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2,直至无白色沉 淀时，向容量瓶加水至刻度。 还原糖含量的测定 过滤上述已定容的样品液，取5mL滤液，再定容到1O0mL(此步视样品的含糖量而 定)。取已稀释的溶液2mL,与标准葡萄糖显色法相同：加铜试剂2mL,煮沸10min,加 砷钼酸试剂2mL,振荡2mL,定容到15ml,620nm波长下比色，记下光密度OD6a0m(至 少重复两次)。 五，结果计算 还原糖含量(%= G稀释液倍数 W10° 式中：G 从标准曲线上查得含糖量（μg) 样品重(g) 六、思考题 举例说明哪些是还原糖？ 参考答案： 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原 糖，其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。 (任大明) 脂类 实验三脂肪碘值的测定 一、目的 掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法，了解测定脂肪碘值的意义。 二、原理
9 待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入 5％硫酸锌 5mL，再慢慢滴入 0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴 Ba(OH)2，直至无白色沉 淀时，向容量瓶加水至刻度。 3．还原糖含量的测定： 过滤上述已定容的样品液，取 5mL 滤液，再定容到 100mL（此步视样品的含糖量而 定）。取已稀释的溶液 2mL，与标准葡萄糖显色法相同：加铜试剂 2mL，煮沸 10min，加 砷钼酸试剂 2mL，振荡 2mL，定容到 15ml，620nm 波长下比色，记下光密度 OD620nm（至 少重复两次）。 五，结果计算 G 稀释液倍数 还原糖含量(％)= W 10 6 式中：G 从标准曲线上查得含糖量（μg） W 样品重（g） 六、思考题 举例说明哪些是还原糖？ 参考答案： 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原 糖，其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。 （任大明） 脂 类 实验三 脂肪碘值的测定 一、目的 掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法，了解测定脂肪碘值的意义。 二、原理
不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素(C,B,上)进行加成反应。不饱 和健数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每100g脂 肪所吸收碘的克数称为该脂肪的碘值古碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是 鉴定和鉴别油脂的一个重要常数 碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反 应。本实验使用Br进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近理论值。溴化碘(B) 的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用 硫代硫酸钠滴定。 加成反应： H HC=CH-+HB 释放碘： IBr+Kl-KBr+2 滴定： →2Nal+NaSO 实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表1与表2： 表1样品最适量和碘值的关系 礁值(g)30以下 30-6060-100100-140140-160160-210 样品数(g) 约1.1 0.50.6 0.3-0.4 02-0.3 0.15-0260.130.15 作用时间(h) 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 表2几种油脂的碘值 名称 重麻子油鱼肝油 棉子油 花生油 猪油 牛油 值(g)175210 154170 104-110 85100 48-64 2541 三、试剂和器材 1.试剂 (1)溴化碘溶液 取12.2g碘，放入1500mL锥形瓶内，缓慢加入1000mL冰乙酸(99.5%)，边加边 摇，同时略温热，使碘溶解。冷却后，加溴约3mL。 注意：所用冰乙酸不应含有还原性物质。检查方法：取2mL冰乙酸，加少许重铬酸 钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在 (2)0.1molL标准硫代硫酸钠溶液 取结晶硫代硫酸钠50g,溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无C0,存在）中。添加硼砂
10 不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl2，Br2，I2）进行加成反应。不饱 和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每 100g 脂 肪所吸收碘的克数称为该脂肪的¡°碘值¡±。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是 鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。 碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反 应。本实验使用 IBr 进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近理论值。溴化碘(IBr) 的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用 硫代硫酸钠滴定。 加成反应： 释放碘： IBr + KI KBr + I2 滴定： I2 + 2NaS2O3 2 NaI + Na2S4O6 实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表 1 与表 2： 表 1样品最适量和碘值的关系 碘 值（g） 30 以下 30~60 60~100 100~140 140~160 160~210 样品数（g） 约 1.1 0.5~0.6 0.3~0.4 0.2~0.3 0.15~0.26 0.13~0.15 作用时间（h） 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 表 2几种油脂的碘值 名 称 亚麻子油 鱼肝油 棉子油 花生油 猪 油 牛 油 碘 值（g） 175~210 154~170 104~110 85~100 48~64 25~41 三、试剂和器材 1．试剂 （1）溴化碘溶液 取 12.2g 碘，放入 1 500mL 锥形瓶内，缓慢加入 1 000mL 冰乙酸（99.5%），边加边 摇，同时略温热，使碘溶解。冷却后，加溴约 3mL。 注意：所用冰乙酸不应含有还原性物质。检查方法：取 2mL 冰乙酸，加少许重铬酸 钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在。 （2）0.1mol/L 标准硫代硫酸钠溶液 取结晶硫代硫酸钠 50g，溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无 CO2 存在）中。添加硼砂 HC CH C C Br H I H + HBr