第四章酶的结构和功能 41酶的活性中心 41.1酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中,只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可 以在肽链的一级结构上相距较远,但通过肽链的折叠、盘旋,使它们在空间上接近,形成活性中 心(或称活性部位)。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务,有些执行催化反应 的任务。我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链 基团称为必需基团 1960年, Koshland将酶分子中 的氨基酸残基或其侧链基团分成4 R163 类:接触残基(直接与底物接触 参与结合或催化的残基;右图中的 Rl、R2、R6、R8、R9、R163、R164、甚酸残基在空间上接近构成活性中心 残基分类 R165),辅助残基(对接触残基的功 能起辅助作用的残基,也位于活性中心:右图中的R4),结构残基(维持构象的残基,此为活性 中心以外的必需基团;右图中的R10、R162、R169),非贡献残基(或称非必需残基,非必需只 是对酶发挥活性而言,它们可能有其他作用,如识别自身物质、运输、防止降解等:右图中的 41.2酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽,形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合,发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合,疏水基团与疏水残基亲合,带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合 例如羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨 基酸时(苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸),反应速度很快。但是当有这些较大疏水基团 的氨基酸残基进入亚位点3~6时,就会减低酶对这些底物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识
1 第四章 酶的结构和功能 4.1 酶的活性中心 4.1.1 酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可 以在肽链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘旋，使它们在空间上接近，形成活性中 心（或称活性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务，有些执行催化反应 的任务。我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链 基团称为必需基团。 1960 年，Koshland 将酶分子中 的氨基酸残基或其侧链基团分成 4 类：接触残基（直接与底物接触， 参与结合或催化的残基；右图中的 R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、 R165），辅助残基（对接触残基的功 能起辅助作用的残基，也位于活性中心；右图中的 R4），结构残基（维持构象的残基，此为活性 中心以外的必需基团；右图中的 R10、R162、R169），非贡献残基（或称非必需残基，非必需只 是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如识别自身物质、运输、防止降解等；右图中的 R3、R5、R7）。 4.1.2 酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。 例如羧肽酶 A 催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨 基酸时（苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反应速度很快。但是当有这些较大疏水基团 的氨基酸残基进入亚位点 3～6 时，就会减低酶对这些底物的亲和力。说明羧肽酶 A 对底物的识
别和结合有多个位点。同时,苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争性抑制剂 42酶活性中心化学基团的鉴定 常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和x-光晶体衍射法。 ) N-C-coH)亚位点 亚仪点3 亚位点2 亚位点2 亚位点4 亚位点5 羧肽酶A活性中心的拓扑学 苯丙氪酸是反应的竟争性抑制剂 42.1化学修饰法 酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰,如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧 基等。如果一个基团是必需的,则被修饰后酶活性会大大下降,甚至完全失活 42.1.1使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非特异性试剂可以修饰特定的某种基团,但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果某种 基团只存在于活性中心,而其他部位没有,就可以用非特异性试剂修饰。如木瓜蛋白酶( papain) 分子中有7个半胱氨酸残基,其中的6个形成3对二硫键,只有一个以自由巯基的形式存在于活 性中心(Cys22-63,Cys56-95,(ysl53-200,自由Cys25;编号从N端开始往C端进行)。在这 种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来修饰,如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性中 心无任何特殊亲和力,但由于这种特殊情况,仍然得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结 果 另外,通过动力学实验证实,还有一个组氨酸残基的咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化 部位(木瓜蛋白酶共有212个氨基酸,有Hs81和Hs59两个Hs)。 Husain和Lowe用1,3-二 溴丙酮修饰木瓜蛋白酶,在pH56,1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白酶的活性。对修饰后的 酶进行氨基酸分析,发现少一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮(2-1C)的修饰实验中,发现修饰剂
2 别和结合有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶 A 的竞争性抑制剂。 4.2 酶活性中心化学基团的鉴定 常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和 x-光晶体衍射法。 4.2.1 化学修饰法 酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧 基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后酶活性会大大下降，甚至完全失活。 4.2.1.1 使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非特异性试剂可以修饰特定的某种基团，但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果某种 基团只存在于活性中心，而其他部位没有，就可以用非特异性试剂修饰。如木瓜蛋白酶（papain） 分子中有 7 个半胱氨酸残基，其中的 6 个形成 3 对二硫键，只有一个以自由巯基的形式存在于活 性中心（Cys22-63，Cys56-95，Cys153-200，自由 Cys25；编号从 N 端开始往 C 端进行）。在这 种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性中 心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结 果。 另外，通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化 部位（木瓜蛋白酶共有 212 个氨基酸，有 His81 和 His159 两个 His）。Husain 和 Lowe 用 1,3-二 溴丙酮修饰木瓜蛋白酶，在 pH5.6，1 克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白酶的活性。对修饰后的 酶进行氨基酸分析，发现少一个组氨酸。在用 1,3-二溴丙酮（2- 14C）的修饰实验中，发现修饰剂
连接了Cys25和Hs-159两个残基,因此知道了这两个基团之间的距离在5A以内。这个结论通 过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。 由于酶活性部位微环境的影响,活性中心的基团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性 中心以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性中心的Ser能优先地被C-碘乙 酸标记;牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸标记,其LyS4l的ε-NH可优先地 被氟二硝基苯标记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂的反应性很低。 要充分利用高反应性的情况 42.1.2差示标记法 这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中 心,使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团,然后透析除去保护剂(即竞争性抑制剂和底物), 再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中 +R一 R为非特异性试剂 R 十R→ P为竟争性抑制齐 R*为放射性标记的非特异性试剂 胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性 基团存在。ψ胰蛋白酶(Lys6-le7之间断 甘氨酰胺缩合 第一次修饰的胰酶 裂成为β胰蛋白酶;Lys6-le7和 苯甲眯存在下去除反应物和抑制剂 [4C]甘氨酰胺缩合 Lys13l-Ser32两处断裂成为a胰蛋白酶 去除反应物第二次修饰的肤酶*4 8M乐中 Lys6-Ile7 Lysl31-Ser 132 分离肽 去除反应物 切断 酶消化 Lysl76-Aspl77三处断裂成为中胰蛋白 酶)失去了水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键的能力,而保留了一般的酯酶活性,估计Aspl77
3 连接了 Cys-25 和 His-159 两个残基，因此知道了这两个基团之间的距离在 5 A 以内。这个结论通 过 x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。 由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性 中心以外的基团的反应性高或低。如 3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性中心的 Ser 能优先地被 14C-碘乙 酸标记；牛胰核糖核酸酶活性中心的 His 能优先地被碘乙酸标记，其 Lys-41 的ε－NH2 可优先地 被氟二硝基苯标记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂的反应性很低。 要充分利用高反应性的情况。 4.2.1.2 差示标记法 这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中 心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂和底物）， 再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中 心。 胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性 基团存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7 之间断 裂成为β胰蛋白酶； Lys6-Ile7 和 Lys131-Ser132 两处断裂成为α胰蛋白酶； Lys6-Ile7 、 Lys131-Ser132 和 Lys176-Asp177 三处断裂成为ψ胰蛋白 酶）失去了水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般的酯酶活性，估计 Asp177
的βCOOH可能与结合底物有关(与底物中的碱性氨基酸结合)。Ey和 Nagar的实验证明了 推测。他们用苯甲脒( benzamidine,CHsC(=NH)NH2)作为β胰蛋白酶的竞争 性抑制剂,以1-乙基3-二甲氨丙 亚胺为缩合剂 1-ethyl-3-dimethylaminoprop carbodiimide C2H5-N=C=N-(CH2)N(CH3)2), CH2-CH-C-0-C2H 以甘氨酰胺( glycine amide)为 修饰剂,以差示标记法证明了 甲基苯磺 苯丙氨酸 TPCK Aspl77是结合底物的一个基 团。酶的羧基与甘氨酰胺以酰胺mc2-cm2Bc2c0c2H2-CB2-CE2-Cn2<CB2-HC-CH1 键结合后几乎完全抑制了酶水 解N-a-苯甲酰基-L精氨酸乙 基苯磺酰赖氨酸乙酯CH WE(N- -benzoyl-L-arginine ethyl ester)的能力 有时加了保护剂后使有些活性中心外的可修饰基团不能被修饰,也有时不能完全阻止对活性 中心基团的修饰,这是差示标记法的缺点。 42.1.3亲和标记 A.Ks型亲和标记 亲和标记是以带有高反应性基团的底物类似物与酶的活性中心结合,然后高反应性基团与酶 活性中心的基团反应,形成共价结合,这称为Ks型亲和标记。如胰凝乳蛋白酶用TPCK亲和标 记,胰蛋白酶用TLCK亲和标记。再如磷酸丙糖异构酶的底物是,亲和标记物为。 B.Kcat型亲和标记 Kcat型修饰剂的专一性不仅取决于修饰剂与酶结合的亲和力,而且取决于它作为酶的底物 的有效性。这种修饰剂具有潜在的化学反应基团,当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的 基团,与酶的活性中心共价结合,因此这类化合 HO-CH2-C-CH2-(P [或BrCH2=C-CH 底物 亲和标记物
4 的β－COOH 可能与结合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。Eyl 和 Inagami 的实验证明了 上述 推测。他们用苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰蛋白酶的竞争 性抑制剂，以 1-乙基-3-二甲氨丙 基 碳 二 亚 胺 为 缩 合 剂 （ 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide ， C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2）， 以甘氨酰胺（glycine amide）为 修饰剂，以差示标记法证明了 Asp177 是结合底物的一个基 团。酶的羧基与甘氨酰胺以酰胺 键结合后几乎完全抑制了酶水 解 N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙 酯 （ N- α -benzoyl-L-arginine ethyl ester）的能力。 有时加了保护剂后使有些活性中心外的可修饰基团不能被修饰，也有时不能完全阻止对活性 中心基团的修饰，这是差示标记法的缺点。 4.2.1.3 亲和标记 A．Ks 型亲和标记 亲和标记是以带有高反应性基团的底物类似物与酶的活性中心结合，然后高反应性基团与酶 活性中心的基团反应，形成共价结合，这称为 Ks 型亲和标记。如胰凝乳蛋白酶用 TPCK 亲和标 记，胰蛋白酶用 TLCK 亲和标记。再如磷酸丙糖异构酶的底物是，亲和标记物为。 B．Kcat 型亲和标记 Kcat 型修饰剂的专一性不仅取决于修饰剂与酶结合的亲和力，而且取决于它作为酶的底物 的有效性。这种修饰剂具有潜在的化学反应基团，当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的 基团，与酶的活性中心共价结合，因此这类化合
物又称为“自杀底物( suicide substrate)”。如3,5/4,6-环己烯四醇B环氧化物具有与葡萄糖吡喃 环相似的结构,它对糖苷酶有很高的亲和力,分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化 作用下,发生类似底物质子化的变化而受到活化,变成对酶有高度反应活性的基团,能专一地不 可逆地作用不同来源的β葡萄糖苷酶 C.光亲和标记 个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶的活性中心,照光后受光解激活,产生高反应性 基团,与酶的活性中心共价结合。0 hy 常见的试剂是光解时给出高度易 R-C-CH R-M3—)R-N: 碳烯 硝烯 反应的碳烯的重氮化合物或硝烯 的叠氮化合物。 在植物生理学中,用氚偶氮一IAA作光亲和标记试剂,经紫外光照射后,从番茄茎细胞质膜 上分离出了IAA受体蛋白。 表、某些常用的修饰剂 氨基酸残基 修饰剂 C 汞制剂,如对氯汞苯甲酸;二硫化物,如5,5′—二硫二(2-硝基苯甲酸) 碘乙酰胺 L 24,6-三硝基苯磺酸:磷酸吡哆醛(±还原试剂如NaBH4) His 二乙基焦碳酸盐:光氧化 Ar 苯乙二醛;2,3-丁二酮 四硝基甲烷:N-乙酰咪唑 Trp ;N-溴代丁二酰亚胺 A9,Gu水溶性碳二亚胺+亲核试剂如Gly甲酯 鉴别化学修饰剂是否已经引入酶的10 with substrate 活性中心,有下列两个标准 No substrate a.酶活性的丧失程度与修饰的程度成正 比 degree of mo duficaf
5 物又称为“自杀底物（suicide substrate）”。如 3,5/4,6-环己烯四醇 B 环氧化物具有与葡萄糖吡喃 环相似的结构，它对糖苷酶有很高的亲和力，分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化 作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地不 可逆地作用不同来源的β－葡萄糖苷酶。 C．光亲和标记 一个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶的活性中心，照光后受光解激活，产生高反应性 基团，与酶的活性中心共价结合。 常见的试剂是光解时给出高度易 反应的碳烯的重氮化合物或硝烯 的叠氮化合物。 在植物生理学中，用氚偶氮—IAA 作光亲和标记试剂，经紫外光照射后，从番茄茎细胞质膜 上分离出了 IAA 受体蛋白。 表、某些常用的修饰剂 氨基酸残基 修 饰 剂 Cys 汞制剂，如对氯汞苯甲酸；二硫化物，如 5,5＇－二硫二（2-硝基苯甲酸）； 碘乙酰胺 Lys 2,4,6-三硝基苯磺酸；磷酸吡哆醛（±还原试剂如 NaBH4） His 二乙基焦碳酸盐；光氧化 Arg 苯乙二醛；2,3-丁二酮 Tyr 四硝基甲烷；N-乙酰咪唑 Trp 碘；N-溴代丁二酰亚胺 Asp, Glu 水溶性碳二亚胺＋亲核试剂如 Gly 甲酯 鉴别化学修饰剂是否已经引入酶的 活性中心，有下列两个标准： a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正 比