第六章pH、温度、抑制剂和活化剂对酶反应速度的影响 6.lpH对酶反应速度的影响 6.1.1酶反应的最适pH 如果在不同pH条件下测定酶反应速度,可得到左图中的曲线 A最适pH为68如果将酶在不同plH条件下预保温,然后在pH68 下测酶反应速度,得到曲线B,说明pH5~8(除了pH68附近)4 使酶可逆失活,当pH回到68时,酶活性可完全恢复;当pH〉8或pH〈5时,酶发生了不可 逆失活。 一些酶的最适pH和等电点 底物 等电点 最适反应pH α一淀粉酶(猪胰) 淀粉 5.2~5.6 β一淀粉酶(麦芽) 淀粉 6.0 5.2 蔗糖酶 蔗糖 5.0 4.5 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 5.0 8.4 核糖核酸酶(牛胰) 核糖核酸 78 78 胃蛋白酶 各种蛋白质 1.5~2.5 胰蛋白酶 各种蛋白质 胰凝乳蛋白酶 各种蛋白质 8.1~8.6 木瓜蛋白酶 各种蛋白质 9.0 5.0~5.5 菠萝蛋白酶 各种蛋白质 9.5~10.0 6.0~6.5 脲酶 尿素 5.0~5.1 6.4~7 脱羧酶(酵母) 丙酮酸 5.1 过氧化氢酶(也叫触酶,牛肝) H,O 5.6 5.7 醛缩酶(兔肌) 果糖二磷酸 6.0 7.5~8.5 己糖激酶(酵母) 葡萄糖,AIP 4.5~4.8 8~9 黄嘌呤氧化酶(牛乳) 黄嘌呤 6.7 8.5~9.0 注意最适pH与等电点的差别。与等电点相比,最适pH偏酸的说明要在带正电荷的情况下 工作,最适pH偏碱的说明要在带负电荷的情况下工作 61.2最适pH的解释
1 第六章 pH、温度、抑制剂和活化剂对酶反应速度的影响 6.1 pH 对酶反应速度的影响 6.1.1 酶反应的最适 pH 如果在不同 pH 条件下测定酶反应速度，可得到左图中的曲线 A,最适 pH为 6.8。如果将酶在不同 pH 条件下预保温，然后在 pH6.8 下测酶反应速度，得到曲线 B，说明 pH5～8（除了 pH6.8 附近） 使酶可逆失活，当 pH 回到 6.8 时，酶活性可完全恢复；当 pH 〉8 或 pH〈5 时，酶发生了不可 逆失活。 一些酶的最适 pH 和等电点 注意最适 pH 与等电点的差别。与等电点相比，最适 pH 偏酸的说明要在带正电荷的情况下 工作，最适 pH 偏碱的说明要在带负电荷的情况下工作。 6.1.2 最适 pH 的解释 酶 底物 等电点 最适反应 pH α－淀粉酶（猪胰） 淀粉 5.2～5.6 6.9 β－淀粉酶（麦芽） 淀粉 6.0 5.2 蔗糖酶 蔗糖 5.0 4.5 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 5.0 8.4 核糖核酸酶（牛胰） 核糖核酸 7.8 7.8 胃蛋白酶 各种蛋白质 3.8 1.5～2.5 胰蛋白酶 各种蛋白质 7.8 7.5 胰凝乳蛋白酶 各种蛋白质 8.1～8.6 8～9 木瓜蛋白酶 各种蛋白质 9.0 5.0～5.5 菠萝蛋白酶 各种蛋白质 9.5～10.0 6.0～6.5 脲酶 尿素 5.0～5.1 6.4～7.6 脱羧酶（酵母） 丙酮酸 5.1 6.0 过氧化氢酶（也叫触酶，牛肝） H2O2 5.6 5.7 醛缩酶（兔肌） 果糖二磷酸 6.0 7.5～8.5 己糖激酶（酵母） 葡萄糖，ATP 4.5～4.8 8～9 黄嘌呤氧化酶（牛乳） 黄嘌呤 6.7 8.5～9.0
酶分子中含有多种可解离的基团,如一COOH、一NH2、一SH、一OH、咪唑基、胍基等。 在最适pH时,各基团的解离状态处于使构象正常及活性中心处于结合底物和催化反应的最佳状 态。当pH偏离最适pH时,活性中心基团的解离状态发生变化,使酶与底物的结合能力(亲和 力)下降,催化能力也下降,致使酶活性下降,即保持正确解离状态的酶分子比例下降。若pH 偏离得太多,导致构象发生不可逆变化,就会使酶变性失活。如溶菌酶活性中心的两个氨基酸只 有处于Asp52-CO和Gu35-COOH状态下才具有活性 底物的解离状态也受pH的影响,从而影响到底物与酶的结合及被催化反应 6.1.3酶的酸碱稳定性 般来说,酶反应的最适pH也是使酶最稳定的pH,偏离的plH会使酶分子的构象发生变化 构象变化的程度与pH偏离的程度及偏离pH处理的时间有关。若pH偏离不多,或处理时间较 短,回复到最稳定pH后,酶活性可得到恢复,这种恢复也是随着时间的推移逐渐发生的。若ph 偏离较多或处理的时间较长,则酶发生不可逆失活, 6.14pH影响酶反应速度的动力学 下面讨论几种不同的解离体系的动力学,并假定在实验涉及到的pH范围内,酶的构象不发 生变化 6141游离酶和ES复合物二者的解离体系 A.解离模式 假定各可逆过程均迅速达到平衡,ESH→EH+P为限速反应。 B.速度方程的推导 用迅速平衡法处理: EHTLH [EH2] EHTI EH2TS K EHT EH+P TEASTH] LEHS
2 酶分子中含有多种可解离的基团，如－COOH、－NH2、－SH、－OH、咪唑基、胍基等。 在最适 pH 时，各基团的解离状态处于使构象正常及活性中心处于结合底物和催化反应的最佳状 态。当 pH 偏离最适 pH 时，活性中心基团的解离状态发生变化，使酶与底物的结合能力（亲和 力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降，即保持正确解离状态的酶分子比例下降。若 pH 偏离得太多，导致构象发生不可逆变化，就会使酶变性失活。如溶菌酶活性中心的两个氨基酸只 有处于 Asp52－COO－和 Glu35－COOH 状态下才具有活性。 底物的解离状态也受 pH 的影响，从而影响到底物与酶的结合及被催化反应。 6.1.3 酶的酸碱稳定性 一般来说，酶反应的最适 pH 也是使酶最稳定的 pH，偏离的 pH 会使酶分子的构象发生变化， 构象变化的程度与 pH 偏离的程度及偏离 pH 处理的时间有关。若 pH 偏离不多，或处理时间较 短，回复到最稳定 pH 后，酶活性可得到恢复，这种恢复也是随着时间的推移逐渐发生的。若 pH 偏离较多或处理的时间较长，则酶发生不可逆失活。 6.1.4 pH 影响酶反应速度的动力学 下面讨论几种不同的解离体系的动力学，并假定在实验涉及到的 pH 范围内，酶的构象不发 生变化。 6.1.4.1 游离酶和 ES 复合物二者的解离体系 A．解离模式 假定各可逆过程均迅速达到平衡，ESH→EH＋P 为限速反应。 B．速度方程的推导 用迅速平衡法处理： 1 2 [ ] [ ][ ] Ke EH EH H = + + ………① 2 [ ] [ ][ ] Ke EH E H = − + ………② 1 2 [ ] [ ][ ] Kes EH S EHS H = + + ………③
LES[HTI K EHST TEHIS K [EHST 3 由②⑤得VE/k。,K,,m,由得[EH=EHSl IHSI K。L[H 由①⑤得[EH21=KEHS]:由④得[ES-1KeES1 [H+] 由③得[EHS1=[团1.EHS1 K V=k2[EHS], [EJo=[E]+[EH]+[EH2*]+[ES ]+[EHS]+[EH2*S]. K2IEHS] [El E]+[EH]+[EH,]+[ES"]+[EHS]+[EHS 将式⑥代入上式得 k2[EJLEHS] KaK K K: IH1 Kes2 +1+H)-[EHS [H][S][S]K[S][H] 分子分母同乘以S]得 k2[E]0[S] K'(1+H Ke)+[S](1+ Kes [H* [H].K 分子分母同除以1+ 得 Ke [hI
3 2 [ ] [ ][ ] Kes EHS ES H = − + ………④ ' [ ] [ ][ ] s K EHS EH S = ………⑤ 由②⑤得 [ ] [ ][ ] ' [ ] 2 EHS H S K K E e s = + − ； 由⑤得 [ ] [ ] ' [ ] EHS S K EH s = ； 由①⑤得 [ ] [ ] '[ ] [ ] 1 2 EHS K S K H EH e s = + + ； 由④得 [ ] [ ] [ ] 2 EHS H K ES es = + − ； 由③得 [ ] [ ] [ ] 1 2 EHS K H EH S es = + + ； ∵ V = k2[EHS]， [E]0 = [E－ ]＋[EH]＋[EH2 + ]＋[ES－ ]＋[EHS]＋[EH2 +S]， ∴ [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 2 2 2 0 E EH EH ES EHS EH S k EHS E V − + − + + + + + + = 将式⑥代入上式得 ) [ ] [ ] 1 [ ] [ ] '[ ] [ ] ' [ ][ ] ' ( [ ] [ ] 1 2 1 2 2 0 EHS K H H K K S K H S K H S K K k E EHS V es es e e s s s + + + + + = + + + + 分子分母同乘以[S]得 ) [ ] [ ] ) [ ](1 [ ] [ ] '(1 [ ] [ ] 2 1 2 1 2 0 + + + + + + + + + = H K K H S H K K H K k E S V es es e e s 分子分母同除以 [ ] [ ] 1 2 1 + + + + H K K H es es 得
keLo [H].K K Km +SI K∴-KnV1+s Kes [hi 式中k2[E]=Vm。将上式取双倒数形式得 × 1-0+1 (+H+] K H S Ke hl 讨论 H]既影响Vm",又影响Km。当[H]很高或很低时,式子可简化,得Kn的简化式, 但意义不大 D.作图法求常数 a.斜率及截距的再作图法 当Kel≥100Ke2,Kes≥100Kes2时,可用本法求Ke、Ke2、Kes、Kes2、Ks、Vm等常 数 式⑧中的斜率和截距整理得 K'K 斜率 [H] K VR [h L 截距 y K [H]+ Kesi 根据式⑧,在不同的pH下作直线,每一个pH可以得到一个斜率和一个截距。 当H较高时,上面两式中的一,项可以忽略不计,剩下的部分为直线方程。以斜率对[ 作图得左上图,以截距对[作图得右上图 当[]很低时,上面两式中的[H项可以忽略不计,以斜率对 y+作图得左下图,以截距
4 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 1 [ ] [ ] 1 ' [ ] [ ] [ ] 1 [ ] 2 1 2 1 2 1 2 0 K S V S S H K K H H K K H K S H K K H k E V H m H m e e es es s es es + = + + + + + + + = + + + + + + + + ……………⑦ 式中 k 2 [E]0 = Vm 。将上式取双倒数形式得 ) [ ] [ ] (1 1 [ ] 1 ) [ ] [ ] (1 1 ' 2 1 2 1 + + + + = + + + + + H K K H H S V K K H V K V es es e e s m m …………⑧ C．讨论 [H+ ]既影响 Vm H +，又影响 Km H +。当[H+ ]很高或很低时，式子可简化，得 Km H + 的简化式， 但意义不大。 D．作图法求常数 a．斜率及截距的再作图法： 当 Ke1≥100 Ke2，Kes1≥100 Kes2 时，可用本法求 Ke1、Ke2 、Kes1、Kes2 、Ks’、Vm等常 数。 式⑧中的斜率和截距整理得 斜率＝ m m Vm K V H K K H V K K s e s e s ' [ ] ' 1 [ ] ' 2 1 + + + + 截距＝ m m m H m V H V K H V K V es es 1 [ ] 1 [ ] 1 1 2 1 = + + + + + 根据式⑧，在不同的 pH 下作直线，每一个 pH 可以得到一个斜率和一个截距。 当[H+ ]较高时，上面两式中的 [ ] 1 + H 项可以忽略不计，剩下的部分为直线方程。以斜率对[H+ ] 作图得左上图，以截距对[H+ ]作图得右上图。 当[H+ ]很低时，上面两式中的[H+ ]项可以忽略不计，以斜率对 [ ] 1 + H 作图得左下图，以截距
对—作图得右下图。 [H·]较高时斜率对[H+]的再作图 [H·]较高时截距对[H+]的再作图 面 [HY很低时斜率对x+的再作图 [H]很低时截距对 的再作图 从这4个图中,可得出各个常数。但如果Ke和Ke相近,或Kes和Kes2相近,或pH居 中,则不能忽略任何一项。 Dixon-Webb对数作图法 此方法要求pKe和pke2及pkes和pKes2的差距≥3.5个pH单位。以gVn对pH作图可 VH 求得pKes和pKes2,以l一一对pH作图可求得pke和pKe2。 K 根据式⑦ ,H”=g-gHm 当处于低pH条件时,[H很大, 孓些可以忽略不计,因很大,1也可以省略,故上 [H] 式可写成 liM =lg -lg[+1 lg Vm =lg Vm-lg[H]+lg KesI
5 对 [ ] 1 + H 作图得右下图。 从这 4 个图中，可得出各个常数。但如果 Ke1 和 Ke2 相近，或 Kes1 和 Kes2 相近，或 pH 居 中，则不能忽略任何一项。 b．Dixon-Webb 对数作图法 此方法要求 pKe1 和 pKe2 及 pKes1 和 pKes2 的差距≥3.5 个 pH 单位。以 + H Vm lg 对 pH 作图可 求得 pKes1 和 pKes2，以 + + H m H m K V lg 对 pH 作图可求得 pKe1 和 pKe2 。 根据式⑦， [ ] [ ] 1 2 1 + + + + + = H K K H V V es es H m m ， ) [ ] [ ] lg lg lg (1 2 1 + + + = − + + H K K H V V es es m H m 当处于低 pH 条件时，[H+ ]很大， [ ] 2 + H Kes 可以忽略不计，因 1 [ ] Kes H + 很大，1 也可以省略，故上 式可写成 1 [ ] lg lg lg Kes H V Vm H m + + = − ， 1 lgV lgVm lg [H ] lg Kes H m = − + + +