第九章固定化生物催化剂 91酶的固定化方法概述: 酶催化剂可以分为几种主要类型,包括游离酶、游离细胞(发酵)、固定化酶、固定化细 胞或细胞器,它们都可以用于工业生产。与游离酶和游离细胞相比,固定化酶和固定化细胞有着 特别的优越性。游离酶与底物混在一起反应,随着反应时间的延长,产物积累,反应速度会逐渐 下降;只能采用分批法生产,反应结束后酶不能回收:有酶在反应混合液中,给产物的分离增加 了困难。发酵需要添加许多营养物质,成本高;易染杂菌:发酵液的成分复杂,产物分离困难 易造成环境污染。固定化酶和固定化细胞操作方便:对微生物污染不敏感:容易实现连续生产和 自动化生产,即使是批式生产也能回收生物催化剂反复使用;产物的分离简单;酶经固定化后稳 定性增加。使用非增殖的固定化细胞仅需要维持催化反应的能量,因此效率比发酵法高。固定化 细胞的生长阶段和催化反应阶段是分开进行的,可以各自选择最优化的条件,而发酵中这两步是 在同一设备中同时进行的,操作条件只能是两种要求之间的折衷 酶固定化的研究最早可以追溯到1916年, Nelson和 Griffin首先发现酵母蔗糖酶能被骨碳 粉末吸附,并在吸附状态下仍有酶活性。1953年, Grubhofer和 Schleith为应用目的而积极开展 固定化酶的研究工作,他们将聚氨苯乙烯树脂重氮化,使羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸 酶等结合在树脂上,实现了酶的固定化。1969年千火田一郎等首先在工业生产中应用固定化氨 基酰化酶生产L氨基酸。至今已有多种固定化酶获得工业规模的应用,如固定化葡萄糖异构酶 生产高果糖浆,固定化青霉素酰化酶生产6-氨基青霉烷酸,固定化微生物细胞生产L天冬氨酸 和L苹果酸,固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等 安徽医科大学用固定在聚酯片上的杂交瘤细胞,生产用于血型鉴定的单克隆抗体(可查一 下1997年2月上旬的健康报) 固定化酶的制备方法可分为三大类:a.载体结合法;b.交联法:c.包埋法。 9.1.1载体结合法: 它是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同,又可分为物理吸 附、离子结合和共价结合三种 9.1.1.1物理吸附: 可用于物理吸附制备固定化酶的载体很多,如活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高岭石、氧 化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、淀粉、合成树脂、陶瓷等。此外还有疏水性的载体如丁基或 己基葡聚糖凝胶可以疏水性吸附酶。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏,酶的髙级结构变化 少,操作简便的优点。缺点是酶与载体的结合力弱,酶易脱落
1 第九章 固定化生物催化剂 9.1 酶的固定化方法概述： 酶催化剂可以分为几种主要类型，包括游离酶、游离细胞（发酵）、固定化酶、固定化细 胞或细胞器，它们都可以用于工业生产。与游离酶和游离细胞相比，固定化酶和固定化细胞有着 特别的优越性。游离酶与底物混在一起反应，随着反应时间的延长，产物积累，反应速度会逐渐 下降；只能采用分批法生产，反应结束后酶不能回收；有酶在反应混合液中，给产物的分离增加 了困难。发酵需要添加许多营养物质，成本高；易染杂菌；发酵液的成分复杂，产物分离困难； 易造成环境污染。固定化酶和固定化细胞操作方便；对微生物污染不敏感；容易实现连续生产和 自动化生产，即使是批式生产也能回收生物催化剂反复使用；产物的分离简单；酶经固定化后稳 定性增加。使用非增殖的固定化细胞仅需要维持催化反应的能量，因此效率比发酵法高。固定化 细胞的生长阶段和催化反应阶段是分开进行的，可以各自选择最优化的条件，而发酵中这两步是 在同一设备中同时进行的，操作条件只能是两种要求之间的折衷。 酶固定化的研究最早可以追溯到 1916 年，Nelson 和 Griffin 首先发现酵母蔗糖酶能被骨碳 粉末吸附，并在吸附状态下仍有酶活性。1953 年，Grubhofer 和 Schleith 为应用目的而积极开展 固定化酶的研究工作，他们将聚氨苯乙烯树脂重氮化，使羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸 酶等结合在树脂上，实现了酶的固定化。1969 年千火田一郎等首先在工业生产中应用固定化氨 基酰化酶生产 L-氨基酸。至今已有多种固定化酶获得工业规模的应用，如固定化葡萄糖异构酶 生产高果糖浆，固定化青霉素酰化酶生产 6-氨基青霉烷酸，固定化微生物细胞生产 L-天冬氨酸 和 L-苹果酸，固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等。 安徽医科大学用固定在聚酯片上的杂交瘤细胞，生产用于血型鉴定的单克隆抗体（可查一 下 1997 年 2 月上旬的健康报）。 固定化酶的制备方法可分为三大类：a. 载体结合法；b. 交联法；c. 包埋法。 9.1.1 载体结合法： 它是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸 附、离子结合和共价结合三种。 9.1.1.1 物理吸附： 可用于物理吸附制备固定化酶的载体很多，如活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高岭石、氧 化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、淀粉、合成树脂、陶瓷等。此外还有疏水性的载体如丁基或 己基葡聚糖凝胶可以疏水性吸附酶。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化 少，操作简便的优点。缺点是酶与载体的结合力弱，酶易脱落
物理吸附法也能固定微生物细胞。 91.1.2离子结合: 这是通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。作为此法的载体 有各种离子交换纤维素,离子交换葡聚糖,离子交换树脂等。离子结合法的优缺点与物理吸附法 相似,但比物理吸附的结合力要强。当缓冲液的pH发生变化或离子强度较高时,酶易脱落。1969 年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用DEAE-葡聚糖凝胶固定的 91.1.3共价结合 这是酶以共价键结合于载体的固定化方法。可与载体结合的酶的功能团有α或ε-氨基,α、 β或γ-羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等,但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活 性所必需的,否则往往造成固定后酶活性完全丧失。共价结合的方法可分为两类,一类是先将载 体上的有关基团活化,然后与酶的有关基团偶联;另一类是用双功能分子连接载体和酶 用于共价结合的载体有葡聚糖、琼脂糖、纤维素、胶原、蚕丝、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、 尼龙、活性碳、硅藻土、多孔玻璃、不锈钢、磁性氧化铁、砂等 共价结合法与物理吸附法及离子交换法相比,反应条件较激烈,操作复杂,会引起酶构象 变化,酶活性丧失较多。酶活回收率一般在30%左右,有时甚至连底物的专一性也会发生变化 但酶与载体结合牢固,不易脱落:回收的酶活性稳定性较高。 91.2交联法: 这是用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联成立体化网状结构的固定化方法。此法与共 价结合法一样也是利用共价键固定酶的,所不同的是它不使用载体。作为交联剂的有形成希夫碱 的戊二醛,形成肽键的异氰酸酯,产生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。交联法反应条件比较激 烈,固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶 比活性的提高。 氰酸(HOC≡N) 硫氰酸H-S-C≡N), 异氰酸(H-N=C=O) 异硫氰酸HN=C=S), 异氰酸酯(R-N=C=O) 异硫氰酸酯(R-N=C=S)。 9.1.3包埋法: 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型, 将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需要与酶形成共价键的反应,几乎不改变 酶的高级结构,酶活回收率高,因此可以用于许多酶、细胞、细胞器的固定化。但在发生化学聚 合反应时包埋,酶容易失活,必须小心设计反应条件。包埋法只适合于固定那些底物和产物均为 小分子的酶,对于那些作用于大分子的酶来说是不合适的,因为只有小分子底物和产物才能通过
2 物理吸附法也能固定微生物细胞。 9.1.1.2 离子结合： 这是通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。作为此法的载体 有各种离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。离子结合法的优缺点与物理吸附法 相似，但比物理吸附的结合力要强。当缓冲液的 pH 发生变化或离子强度较高时，酶易脱落。1969 年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用 DEAE-葡聚糖凝胶固定的。 9.1.1.3 共价结合： 这是酶以共价键结合于载体的固定化方法。可与载体结合的酶的功能团有α或ε-氨基，α、 β或γ-羧基，巯基，羟基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活 性所必需的，否则往往造成固定后酶活性完全丧失。共价结合的方法可分为两类，一类是先将载 体上的有关基团活化，然后与酶的有关基团偶联；另一类是用双功能分子连接载体和酶。 用于共价结合的载体有葡聚糖、琼脂糖、纤维素、胶原、蚕丝、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、 尼龙、活性碳、硅藻土、多孔玻璃、不锈钢、磁性氧化铁、砂等。 共价结合法与物理吸附法及离子交换法相比，反应条件较激烈，操作复杂，会引起酶构象 变化，酶活性丧失较多。酶活回收率一般在 30％左右，有时甚至连底物的专一性也会发生变化。 但酶与载体结合牢固，不易脱落；回收的酶活性稳定性较高。 9.1.2 交联法： 这是用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联成立体化网状结构的固定化方法。此法与共 价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。作为交联剂的有形成希夫碱 的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，产生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。交联法反应条件比较激 烈，固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶 比活性的提高。 氰酸 （H-O-C≡N）, 硫氰酸 （H-S-C≡N）, 异氰酸 （H-N=C=O）, 异硫氰酸 （H-N=C=S）, 异氰酸酯 （R-N=C=O）, 异硫氰酸酯 （R-N=C=S）。 9.1.3 包埋法： 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型， 将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需要与酶形成共价键的反应，几乎不改变 酶的高级结构，酶活回收率高，因此可以用于许多酶、细胞、细胞器的固定化。但在发生化学聚 合反应时包埋，酶容易失活，必须小心设计反应条件。包埋法只适合于固定那些底物和产物均为 小分子的酶，对于那些作用于大分子的酶来说是不合适的，因为只有小分子底物和产物才能通过
高分子凝胶的网格及半透膜扩散,而大分子底物无法与网格中或微囊中的酶或细胞接触。 91.3.1网格型 形成网格有两种方法,一种方法是把酶或细胞与能形成高分子聚合物的单体混合,然后使 单体聚合成网格状凝胶,如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂等,酶或细胞就被包埋在网格中。 另一种方法是将溶胶状的天然高分子物质与酶或细胞混合,然后凝胶化,如淀粉、琼脂、明胶 胶原、海藻酸、角叉菜胶等 网格型包埋是固定细胞用得最多且最有效的方法。 91.3.2微囊型 微囊通常是直径几微米到几百微米的球状体,内有含酶的溶液,微囊的膜可让小分子物质 通过,但酶不能通过。小分子底物通过扩散进入囊内,经酶反应生成产物后再扩散出来。作为膜 材料的有硝酸纤维素(用乙醇和乙醚混合液溶解则为火棉胶)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯 尼龙、聚酰胺、聚脲等 脂质体:用表面活性剂和卵磷脂制成的液膜微囊 微囊型颗粒比网格型颗粒要小得多,有利于底物和产物的扩散,但微囊制备时反应条件要 求高,制备成本也高。 92固定化技术 921载体固定法 92.1.1物理吸附: 由物理吸附法将酶固定到载体上有三种方法:a.混合浴或振荡浴吸附法;b.反应器中直接 吸附法:c.电淀积法。在三种技术中,实验室制备固定化酶最常采用的技术是混合浴或振荡浴 吸附法。它是将载体加到酶液中搅拌混合或于水浴中连续振荡,使酶均匀吸附到载体上。工业上 最好采用在反应器中直接吸附的方法,先将要使用的载体装入反应器中,然后将酶加入,并进行 搅动或循环通过反应器。电淀积法是将载体放在酶液中靠近一个电极处,加上电场,酶移向载体, 并沉积在载体表面 吸附效果与许多因素有关,如pH、溶剂性质、离子强度、时间、温度、酶量及吸附剂的量 等。由于蛋白质和吸附剂之间的结合力(主要是氢键、范德华力和疏水作用等)比较弱,需严格 控制这些条件。影响酶吸附到载体上的量的主要因素,是在固定化过程中与单位面积载体接触的 酶浓度,固定化酶活性随酶浓度增加而增加,在较高酶浓度下逐渐接近于饱和值。用吸附法制备 固定化酶时,温度和时间是重要参数,特别是用多孔载体时,这两个参数更加重要,因为把酶固 定到这样的载体上时,扩散是重要因素。 使用物理吸附法固定的酶时,要注意采用酶不易脱落的条件
3 高分子凝胶的网格及半透膜扩散，而大分子底物无法与网格中或微囊中的酶或细胞接触。 9.1.3.1 网格型： 形成网格有两种方法，一种方法是把酶或细胞与能形成高分子聚合物的单体混合，然后使 单体聚合成网格状凝胶，如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂等，酶或细胞就被包埋在网格中。 另一种方法是将溶胶状的天然高分子物质与酶或细胞混合，然后凝胶化，如淀粉、琼脂、明胶、 胶原、海藻酸、角叉菜胶等。 网格型包埋是固定细胞用得最多且最有效的方法。 9.1.3.2 微囊型： 微囊通常是直径几微米到几百微米的球状体，内有含酶的溶液，微囊的膜可让小分子物质 通过，但酶不能通过。小分子底物通过扩散进入囊内，经酶反应生成产物后再扩散出来。作为膜 材料的有硝酸纤维素（用乙醇和乙醚混合液溶解则为火棉胶）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、 尼龙、聚酰胺、聚脲等。 脂质体：用表面活性剂和卵磷脂制成的液膜微囊。 微囊型颗粒比网格型颗粒要小得多，有利于底物和产物的扩散，但微囊制备时反应条件要 求高，制备成本也高。 9.2 固定化技术： 9.2.1 载体固定法： 9.2.1.1 物理吸附： 由物理吸附法将酶固定到载体上有三种方法：a. 混合浴或振荡浴吸附法；b.反应器中直接 吸附法；c. 电淀积法。在三种技术中，实验室制备固定化酶最常采用的技术是混合浴或振荡浴 吸附法。它是将载体加到酶液中搅拌混合或于水浴中连续振荡，使酶均匀吸附到载体上。工业上 最好采用在反应器中直接吸附的方法，先将要使用的载体装入反应器中，然后将酶加入，并进行 搅动或循环通过反应器。电淀积法是将载体放在酶液中靠近一个电极处，加上电场，酶移向载体， 并沉积在载体表面。 吸附效果与许多因素有关，如 pH、溶剂性质、离子强度、时间、温度、酶量及吸附剂的量 等。由于蛋白质和吸附剂之间的结合力（主要是氢键、范德华力和疏水作用等）比较弱，需严格 控制这些条件。影响酶吸附到载体上的量的主要因素，是在固定化过程中与单位面积载体接触的 酶浓度，固定化酶活性随酶浓度增加而增加，在较高酶浓度下逐渐接近于饱和值。用吸附法制备 固定化酶时，温度和时间是重要参数，特别是用多孔载体时，这两个参数更加重要，因为把酶固 定到这样的载体上时，扩散是重要因素。 使用物理吸附法固定的酶时，要注意采用酶不易脱落的条件
921.2离子结合: 离子结合的方法与物理吸附法相似,现举一个将氨基酰化酶结合到 DEAE-Sephadex上的例 子 将充分溶胀的 DEAE-Sephadex A-25用0.05 N Naoh和水洗后,与预先调pH至70~75的 氨基酰化酶酶液(酶活约25 H mol/h/m混合,离子交换剂与酶液的比例为1g湿重的 DEAE- Sephadex A-25加6om酶液。混合物在低温下搅拌过夜,然后除去上清液,依次用水和 0.5mo几L醋酸钠溶液洗涤,就得到固定化酶。酶活性回收一般可达50%左右,可连续使用一个 月左右 921.3共价结合: 共价结合的许多反应与酶的化学修饰的反应相同。 ①重氮化 yr-E HAr-NH2-209>HAr-N=N Ax-N=N-Tyr-酶 芳香重氮基与酶分子上的酚基或咪唑基反应。酶分子中的自由氨基也可参加反应,生成长ym 我国开发出了一种较好的固定化方法,它是在碱性条件下,用β-硫酸酯乙砜基苯 胺(SESA)与纤维素(或其它多糖)载体上的羟基反应,生成对氨基苯磺酰乙基纤维素,再重 氮化,然后与酶偶联。 OH++ HO-S-0-CHe-CH m-→30cm=cm man3-0-cH-cHa-io-i-N+(s-o cH2-CH2“>MB ②形成酰胺键 a.酸酐衍生物:通常是用顺丁烯二酸酐共聚的酸酐衍生物与酶的氨基反应,形成酰胺键,同 时产生的羧基可用加二胺化合物来封闭 +H2N-( b.酰基叠氮衍生物:用含羧基或羟基(羟基先转换成羧基)的载体,加醇成酯,再加肼成酰 肼,再加亚硝酸成酰基叠氮,再与酶分子的氨基反应,生成酰胺 ClCH2COOH ÷o-cH2CoOH CH3 OH COOCHa- NH2> Ho-CH2-Co-HN-NH2 NaNo2 O-CH2-CO-N3 o-cH2-co-H(的 c.亚氨碳酸衍生物:溴化氰活化法。 d.异氰酸和异硫氰酸衍生物:在碱性条件下,带有芳香氨基的载体可用光气或硫化光气加以
4 9.2.1.2 离子结合： 离子结合的方法与物理吸附法相似，现举一个将氨基酰化酶结合到 DEAE-Sephadex 上的例 子。 将充分溶胀的 DEAE-Sephadex A-25 用 0.05N NaOH 和水洗后，与预先调 pH 至 7.0～7.5 的 氨基酰化酶酶液( 酶活约 25μmol/h/ml) 混合， 离子交换剂与酶液的比例为 1g 湿重的 DEAE-Sephadex A-25 加 60ml 酶液。 混合物在低温下搅拌过夜， 然后除去上清液，依次用水和 0.15mol/L 醋酸钠溶液洗涤，就得到固定化酶。酶活性回收一般可达 50％左右，可连续使用一个 月左右。 9.2.1.3 共价结合： 共价结合的许多反应与酶的化学修饰的反应相同。 ① 重氮化： 芳香重氮基与酶分子上的酚基或咪唑基反应。酶分子中的自由氨基也可参加反应，生成 我国开发出了一种较好的固定化方法，它是在碱性条件下，用β-硫酸酯乙砜基苯 胺（SESA）与纤维素（或其它多糖）载体上的羟基反应，生成对氨基苯磺酰乙基纤维素，再重 氮化，然后与酶偶联。 ② 形成酰胺键： a. 酸酐衍生物：通常是用顺丁烯二酸酐共聚的酸酐衍生物与酶的氨基反应，形成酰胺键，同 时产生的羧基可用加二胺化合物来封闭。 b. 酰基叠氮衍生物：用含羧基或羟基（羟基先转换成羧基）的载体，加醇成酯，再加肼成酰 肼，再加亚硝酸成酰基叠氮，再与酶分子的氨基反应，生成酰胺。 c. 亚氨碳酸衍生物：溴化氰活化法。 d. 异氰酸和异硫氰酸衍生物：在碱性条件下，带有芳香氨基的载体可用光气或硫化光气加以
修饰,分别生成异氰酸酯和异硫氰酸酯,然后再与酶分子上的氨基反应形成酰胺键或硫代酰胺键。 若载体上带有酰基叠氮基团,可在酸性条件下转变成异氰酸酯,再与酶反应。 HiNgE NH一 十NH-c-N(式中x为或s) HC⊥ Co-N3 ε.酰氯衍生物:将含有羧基的载体如 Amberite irc-50在亚硫酰氯溶液中回流,生成酰氯,可 在低温下与酶反应生成稳定的固定化酶 H2N- CooH一 Co-Cl co-田的 f.环碳酸衍生物:含有羟基的载体如多糖和聚烯丙基醇,在pH7~8含有二氯六环和三乙醇胺 的无水二甲亚砜溶液中,与氯甲酸乙酯反应生成环碳酸衍生物。它以环亚氨碳酸同样的方式与酶 的伯氨基反应。和环亚氨碳酸法相比,这种方法费用低,操作简单,也不用有毒化学试剂。 王zCH 十H2N-每 C=N一( g碳二亚胺法:用碳二亚胺(R-N=C=N-R)活化载体或酶分子上的羧基,然后与酶分子或载 体上的氨基缩合生成酰胺键 ③烷基化和芳基化: a.活性卤素:用甲基丙烯酸和甲基丙烯酸-5-氟-2,4-二-硝基酰替苯胺聚合成的载体上含有活性 氟,可与酶分子上的氨基反应。或给含羟基的载体结合上一含卤素的基团,然后与酶分子的氨基 反应。后一种方法的主要缺点是酶和载体之间的酯键有时不够稳定 CHa-C-COOH H2N-() CH2-X o-Co-CH2-HN- (x=I Et Br) b.环氧氯丙烷:有羟基的载体在三氟化硼乙醚存在下与环氧氯丙烷反应,然后活性氯与酶分 子的氨基反应 4a④。m猫ma,。m-m画 c.三氯均嗪法:先将三氯均嗪与载体上的羟基结合,再与酶分子的氨基结合 Ugi反应:四种功能团(羧基、氨基、醛基、异氰基)同时反应生成N-取代酰胺。 R:,算ga R:2算 R-NH2 →2是g
5 修饰，分别生成异氰酸酯和异硫氰酸酯，然后再与酶分子上的氨基反应形成酰胺键或硫代酰胺键。 若载体上带有酰基叠氮基团，可在酸性条件下转变成异氰酸酯，再与酶反应。 e. 酰氯衍生物：将含有羧基的载体如 Amberite IRC-50 在亚硫酰氯溶液中回流，生成酰氯，可 在低温下与酶反应生成稳定的固定化酶。 f. 环碳酸衍生物：含有羟基的载体如多糖和聚烯丙基醇，在 pH7～8 含有二氯六环和三乙醇胺 的无水二甲亚砜溶液中，与氯甲酸乙酯反应生成环碳酸衍生物。它以环亚氨碳酸同样的方式与酶 的伯氨基反应。和环亚氨碳酸法相比，这种方法费用低，操作简单，也不用有毒化学试剂。 g. 碳二亚胺法：用碳二亚胺（R-N=C=N-R'）活化载体或酶分子上的羧基，然后与酶分子或载 体上的氨基缩合生成酰胺键。 ③ 烷基化和芳基化： a. 活性卤素：用甲基丙烯酸和甲基丙烯酸-5-氟-2,4-二硝基酰替苯胺聚合成的载体上含有活性 氟，可与酶分子上的氨基反应。或给含羟基的载体结合上一含卤素的基团，然后与酶分子的氨基 反应。后一种方法的主要缺点是酶和载体之间的酯键有时不够稳定。 b. 环氧氯丙烷：有羟基的载体在三氟化硼乙醚存在下与环氧氯丙烷反应，然后活性氯与酶分 子的氨基反应。 c. 三氯均嗪法：先将三氯均嗪与载体上的羟基结合，再与酶分子的氨基结合。 d. Ugi 反应：四种功能团（羧基、氨基、醛基、异氰基）同时反应生成 N-取代酰胺