《酶学》课程教学资源（讲义）第五章 酶催化动力学基础

第五章酶催化动力学基础 51引言 酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影 响酶促反应速度的因素包括S]、巴]、P、凹、[A]、pH和温度等。本章重点讨论S]对酶促反应 速度的影响,并且介绍一些基本概念,和简单体系的动力学方程的推导 52反应级数和速度常数 521反应级数 化学反应的级数就是动力学方程中影响反应速度的各反应物浓度项上的指数之和 52.1.1零级反应 反应速度与底物的浓度无关,称为零级反应。当S]大大高于[E]时,可认为是零级反应。 y=2s=2=kn(41),V d[P]=-d[S]=kodt(42)。 分42)式得+1山 零级反应动力学图 [S]o-[Sl=k1(43)。 也即[P]=kt,故[P与t成正比,ko为该零级反应的速度常数,它表明单位时间底物的减 少量或产物的生成量,因次为“C·t1”。 零级反应的半寿期(即一半底物转化成产物所需的时间)1可以由[S1=BS代入式 (43)求得 [SJo-[S]=koti,SJo=kotr, t,-ISYo(4.4)o 2k t1与[S]o成正比,与ko成反比。 521.2一级反应 一级反应动力学图 反应速度与底物浓度成正比(单底物反应),称为一级反应。当[E))[S]时为一级反应

1 第五章 酶催化动力学基础 5.1 引言 酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影 响酶促反应速度的因素包括[S]、[E]、[P]、[I]、[A]、pH 和温度等。本章重点讨论[S]对酶促反应 速度的影响，并且介绍一些基本概念，和简单体系的动力学方程的推导。 5.2 反应级数和速度常数 5.2.1 反应级数 化学反应的级数就是动力学方程中影响反应速度的各反应物浓度项上的指数之和。 5.2.1.1 零级反应 反应速度与底物的浓度无关，称为零级反应。当[S]大大高于[E]时，可认为是零级反应。 0 [ ] [ ] k dt d P dt d S V = − = = （ 4.1 ）， d P d S k dt 0 [ ] = − [ ] = （4.2）。 积分（4.2）式得   − = t t S S d S k dt 0 0 [ ] 0 [ ] [ ] ， S S k t 0 t 0 [ ] −[ ] = （4.3）。 也即 P k t 0 [ ] = ，故[P]与 t 成正比，k0 为该零级反应的速度常数，它表明单位时间底物的减 少量或产物的生成量，因次为“C·t －1”。 零级反应的半寿期（即一半底物转化成产物所需的时间） 2 t 1 可以由 0 [ ] 2 1 [S] t = S 代入式 （4.3）求得 0 0 0 [ ] 2 1 [S] − S = k 2 t 1 ， 0 0 [ ] 2 1 S = k 2 t 1 ， 2 t 1 0 0 2 [ ] k S = （4.4）。 2 t 1 与[S]0 成正比，与 k0 成反比。 5.2.1.2 一级反应 反应速度与底物浓度成正比（单底物反应），称为一级反应。当[E] 〉〉[S]时为一级反应

d[s]=k,[S d[sT kdt(4.6) [S] 式中k为一级反应速度常数。将式(46)积分得 kdt,-(血[S]-hSb)=k hn so-hn s,=k,t t(4.7) [S],2.303 |斜率=k 2.303 将t对gS 作图可得一直线,斜率为 k 2303’k的因次回 为 [S] 将[S]=[S1代入式(47)可以得出t [S]t 对t作图求k1值 Slo 25n 2303g20.693 (4.8)。 k k 在一级反应中,t1与k成反比,而与底物浓度无关 52.13二级反应 反应速度与两个反应物的浓度成正比,称为二级反应,这种反应可以是两个相同的反应物反 应生成产物(2S→P),也可以是两个不同的反应物反应生成产物(A+B→P)。 先看第一种情况(2S→P) d s dr=k[ss]=k2IS (49) S 斜率=k2 d si k,dt(4.10)。 [S] 式中k2为二级反应速度常数。将(4.10)积分得 截距=[sJ0 =kt 1 对t作图求k2值 kt (4.11)

2 [ ] [ ] k1 S dt d S V = − = （4.5）， k dt S d S 1 [ ] [ ] − = （4.6）。 式中 k1 为一级反应速度常数。将式（4.6）积分得   − = t S t S k dt S d S 0 1 [ ] [ ]0 [ ] [ ] ， S S k t t 0 1 − (ln [ ] − ln [ ] ) = ， S S k t 0 t 1 ln [ ] − ln [ ] = 。 即 t k S S t [ ] 2.303 [ ] lg 0 1 = （4.7）。 将 t 对 t S S [ ] [ ] lg 0 作图可得一直线，斜率为 2.303 1 k ， k1 的因次 为“t －1”。 将 0 [ ] 2 1 [S] t = S 代入式（4.7）可以得出 2 t 1 [ ] 2.303 [ ] lg 1 2 0 1 0 k S S = 2 t 1 ， 2 t 1 1 1 2.303 lg 2 0.693 k k = = （4.8）。 在一级反应中， 2 t 1 与 k1 成反比，而与底物浓度无关。 5.2.1.3 二级反应 反应速度与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应，这种反应可以是两个相同的反应物反 应生成产物（2S → P），也可以是两个不同的反应物反应生成产物（A＋B → P）。 先看第一种情况（2S → P）： 2 2 2 [ ][ ] [ ] [ ] k S S k S dt d S V = − = = （ 4.9 ） ， k dt S d S 2 2 [ ] [ ] − = （4.10）。 式中 k2 为二级反应速度常数。将（4.10）积分得   − = t S t S k dt S d S 0 2 [ ] [ ]0 2 [ ] [ ] ， k t S S t 2 0 [ ] 1 [ ] 1 − = ， 0 2 [ ] 1 [ ] 1 S k t S t = + （4.11）

t对一—作图可得一直线,斜率k2,截距 Sb°k2的因次为“C-1…t 将[S]=[Sl代入(4.)可求出t1 ISTo [s K: ', I k,isTo (4.12)。 t1与k2及[SJ都成反比。零级反应中S]越大,t1也越大;二级反应中S]越大,t1反而 越小;一级反应t1与[S无关 再看第二种情况(A+B→P): y=d=-d=k4I,如果=,则与第一种情况的全部推导和结果相同 如果两个反应物中,[SA比[SB]大得多,即[SA])〉[Sa],反应中SA下降的相对值很小,可 以认为保持恒定,此时反应速度只与SB]成正比,其动力学方程式与一级反应的相同,其反应的 速度常数用kobs表示,称为表观反应速度常数。 这种反应表面看起来是一级反应,但实际上是二级反应,故称为假一级反应,kbs在这里也是假 一级反应速度常数 当SA]》[SB]时,有 ds dsB Vad=- SAILs]=kSl,式中k,=k2[S](413) 在恒定[Sa]和不同的[SA时测定反应速度,得出不同[SA时的k由,再按(413)作图,斜率 即为k2 如果[SA]和[S]相差不大,情况比较复杂,这里不作讨论 53酶催化反应动力学方程 531反应初速度的测定 在研究酶反应动力学时,一是改变各种因素(如[S]、田、pH等),二就是测酶反应速度 随着酶反应的进行,底物浓度逐渐下降,产物逐渐积累,酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底

3 t 对 t [S] 1 作图可得一直线，斜率 k2，截距 0 [ ] 1 S 。K2 的因次为“C －1·t －1”。 将 0 [ ] 2 1 [S] t = S 代入（4.11）可求出 2 t 1 2 2 0 0 1 [ ] 1 [ ] 1 k S S − = 2 t 1 ， 2 0 [ ] 1 k S = 2 t 1 ， 2 t 1 2 0 [ ] 1 k S = （4.12）。 2 t 1 与 k2 及[S]0 都成反比。零级反应中[S] 0 越大， 2 t 1 也越大；二级反应中[S] 0 越大， 2 t 1 反而 越小；一级反应 2 t 1 与[S]0 无关。 再看第二种情况（A＋B → P）： [ ][ ] [ ] [ ] k2 A B dt d B dt d A V = − = − = ，如果[A] = [B]，则与第一种情况的全部推导和结果相同。 如果两个反应物中，[SA]比[SB]大得多，即[SA] 〉〉[SB]，反应中[SA]下降的相对值很小，可 以认为保持恒定，此时反应速度只与[SB]成正比，其动力学方程式与一级反应的相同，其反应的 速度常数用 kobs 表示，称为表观反应速度常数。 这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应，kobs 在这里也是假 一级反应速度常数。 当[SA] 〉〉[SB]时，有 [ ][ ] [ ] [ ] [ ] 2 A B obs B A B k S S k S dt d S dt d S V = − = − = = ，式中 [ ] obs 2 S A k = k （4.13）。 在恒定[SB]和不同的[SA]时测定反应速度，得出不同[SA]时的 kobs，再按（4.13）作图，斜率 即为 k2。 如果[SA]和[SB]相差不大，情况比较复杂，这里不作讨论。 5.3 酶催化反应动力学方程 5.3.1 反应初速度的测定 在研究酶反应动力学时，一是改变各种因素（如[S]、[I]、pH 等），二就是测酶反应速度。 随着酶反应的进行，底物浓度逐渐下降，产物逐渐积累，酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底

物和产物浓度变化对酶反应速度的影响,人们采用酶反应的初速度作为衡量的指标。 从理论上来说,作出反应时间对反应物变化量的曲线,从 近0处作曲线的切线,则切线的斜率代表初速度。但实际上切 线无法作准确。 实际使用的初速度测定方法有以下几种 531.1高底物浓度测定法 反应时间 高底物浓度测定法即零级反应近似法。它采用S]>10Km的条件,在V=mS 中,Km Kn +s 可以忽略不计,Ⅴ≈Vm,即与零级反应近似,V为一恒定值,此法必须在无高底物浓度抑制时 才适用,为了避免产物抑制,应在反应的初期测定。 53.1.2低底物浓度测定法 低底物浓度测定法即一级反应近似法。它采用[S]< Km的条件,在_Vn[S] 10 Kn+s 母中的S]可以忽略不计,V=m[S],在不同[S]时测定V,以V对S作图,直线部分的斜率 Kn°在直线部分,[S]乘以得V。 为 531.3使用不同酶量的测定法 反应时间(分钟 酶液量(u1) 在加不同酶量的情况下测 反应速度,作出产物生成量对反画3 0000 应时间的图,然后以酶量对反应 速度作图,此反应速度为反应了 反应时间〔分钟) 液量(1) 不同时间的速度平均值,以不同 的反应时间分别作曲线,在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度 532[]对反应速度的影响 在[S过量的情况下,V对[E成正比;而在[E一定时,(S]与V成双曲线关系

4 物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，人们采用酶反应的初速度作为衡量的指标。 从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从 近 0 处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切 线无法作准确。 实际使用的初速度测定方法有以下几种： 5.3.1.1 高底物浓度测定法 高底物浓度测定法即零级反应近似法。它采用[S]＞10Km 的条件，在 [ ] [ ] K S V S V m m + = 中，Km 可以忽略不计，V≈Vm，即与零级反应近似，V 为一恒定值，此法必须在无高底物浓度抑制时 才适用，为了避免产物抑制，应在反应的初期测定。 5.3.1.2 低底物浓度测定法 低底物浓度测定法即一级反应近似法。它采用[S]＜ 10 1 Km 的条件，在 [ ] [ ] K S V S V m m + = 中，分 母中的[S]可以忽略不计， [S] K V V m m = ，在不同[S]时测定 V，以 V 对[S]作图，直线部分的斜率 为 m m K V 。在直线部分，[S]乘以 m m K V 得 V。 5.3.1.3 使用不同酶量的测定法 在加不同酶量的情况下测 反应速度，作出产物生成量对反 应时间的图，然后以酶量对反应 速度作图，此反应速度为反应了 不同时间的速度平均值，以不同 的反应时间分别作曲线，在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。 5.3.2 [E]对反应速度的影响 在[S]过量的情况下，V 对[E]成正比；而在[E]一定时，[S]与 V 成双曲线关系

[EJo 若酶催化单底物反应机理为E+SE+ P,则V=k]S],也就是V与旧及[S]都 成正比,但实际情况不是这样,这个结果符合以H为催化剂的情况。 若假设底物和酶先形成ES复合物,再由ES转化成产物,其机理可写成 e+ s ks ES—>E+P 并假设第一步可迅速平衡,第二步较慢,是限速步骤。根据这些假设可推导出动力学方程式: =12l5S1,在此式中,ⅴ与成正比,而与S成双曲线关系,符合实际情况,故假设 k。+[S 的机理正确 533单底物—单产物反应 533.1酶—一底物复合物的存在 经过电子显微镜观察、ⅹ光衍射和动力学方法研究,证实了确实有ES复合物存在 5332平衡学说( Henri, Michaelis和 Menten方程) 1902年Heni和 Brown提出了S+EES- →E+P学说:1913年 Michaelis和 Menten完善了这个理论,他们的第一步是快速可逆的平衡,第二步慢,为限速反应。 E+S-→ E+P 在推导动力学方程时,有几点假设:①第一步迅速平衡,第二步慢,即k2((k-1;②[S]) [E],[S]))[ES]:③酶以E和ES两种状态存在 设v为E与S结合的速度,V为ES解离的速度,则 V=k([E]-[ES])([S]-[ES]),V=k-1ES],∵平衡时Ⅴr=Vr, ∴k([E]o-[ES])([S]-[ES])=k-1|ES],又∵:[S]》[ES],[S]-[ESl≈S]

5 若酶催化单底物反应机理为 E＋S E＋ P，则 V = k [E][S]，也就是 V 与[E]及[S]都 成正比，但实际情况不是这样，这个结果符合以 H+为催化剂的情况。 若假设底物和酶先形成 ES 复合物，再由 ES 转化成产物，其机理可写成 E ＋ S ES E＋P 并假设第一步可迅速平衡，第二步较慢，是限速步骤。根据这些假设可推导出动力学方程式： [ ] [ ] [ ] 2 0 k S k E S V s + = ，在此式中，V 与[E]0 成正比，而与[S]成双曲线关系，符合实际情况，故假设 的机理正确。 5.3.3 单底物——单产物反应 5.3.3.1 酶——底物复合物的存在 经过电子显微镜观察、x 光衍射和动力学方法研究，证实了确实有 ES 复合物存在。 5.3.3.2 平衡学说（Henri, Michaelis 和 Menten 方程） 1902年Henri和Brown提出了S＋E ES — →E＋P 学说；1913 年 Michaelis 和 Menten 完善了这个理论，他们的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。 E＋S −−− − −−−→ 1 1 k k ES E＋P 在推导动力学方程时，有几点假设：①第一步迅速平衡，第二步慢，即 k2〈〈 k－1；②[S] 〉〉 [E]，[S] 〉〉[ES]；③酶以 E 和 ES 两种状态存在。 设 Vf为 E 与 S 结合的速度，Vr为 ES 解离的速度，则 Vf＝k1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )， Vr＝k－1 [ES]， ∵ 平衡时 Vf＝Vr ， ∴ k1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )＝k－1 [ES] ， 又∵ [S] 〉〉[ES]， [S]－[ES]≈[S]