第三章酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时,都要遇到对酶的活性、纯度及含量 进行经常的、大量的测定工作,这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力, 检查酶的含量及存在,通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度,即酶的活性来表示 3.1酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小,它既与酶蛋白的浓度有关,又与酶分子的催化能力大 小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示,即um或umg 3.1.1实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下,30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA(三氯乙酸)不溶物所需的酶量;又如T4DNA连接酶的单位定义为:在20 u反应体积中,16℃,30分钟内,将50%的HindⅢ酶切的ADNA片段重新连接起来所需的酶 量。ACC合成酶的单位是:30℃,1小时转化SAM生成 Inmol Aco所需的酶量 3.12国际酶活性单位 1961年,国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准,即在特定的条件下,1分钟转 化1mol底物,或转化1uN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972年,国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位,叫 katal(kat),kata是一个很大的酶活 单位,1kata是指1秒钟转化lmo底物,或转化IN底物有关基团所需的酶量。1kata=6×10u。 3.14转换数 在标准条件下,每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数,可 表示为: max mo1·n1-1,min-1 [Eo l/Kp称为一个催化循环,单位为分钟 3.1.5比活性 酶的纯度往往用比活性来表示,比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量,即单位 质量蛋白质所具有的酶活性,常用的单位为 u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越
1 第三章 酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量 进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力， 检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大 小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即 u/ml 或 u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如 DNA 聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30 分钟内催化 10nmol dNTP 合成为 TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如 T4 DNA 连接酶的单位定义为：在 20 μl 反应体积中，16℃，30 分钟内，将 50%的 HindⅢ酶切的λDNA 片段重新连接起来所需的酶 量。ACC 合成酶的单位是：30℃，1 小时转化 SAM 生成 1nmol ACC 所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961 年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1 分钟转 化 1μmol 底物，或转化 1μN 底物有关基团所需的酶量为 1 个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972 年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫 katal(kat)，katal 是一个很大的酶活 单位，1 katal 是指 1 秒钟转化 1mol 底物，或转化 1N 底物有关基团所需的酶量。1 katal＝6×10u。 3.1.4 转换数 在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在 1 分钟内转换底物成产物的μmol 数，可 表示为： 1/Kp 称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位 质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为 u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越
但在实际工作中,人们为了工作方便,往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行(温度、pH、离子强度、反应时间等),可测定反 应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行,底物减少,产物积累,会使得反应速度变慢。 因此,必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的 近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示,而酶反应速度又与酶 浓度密切相关 321分光光度法( spectrophotometry) 硝酸还原酶将NO3还原成NO2,NO2与加入的显色剂对一氨基苯磺酸和a一萘胺反应 生成玫瑰红色的偶氮化合物,在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD或 NADP为辅酶,NAD或NADP在340nm处光吸收很少,而其还原形式NADH和 NADPH在 340nm处光吸收较大,因此可以测定340nm处的光吸收变化来检 (乳酸脱氢酶) 测NADH和 NADPH的生成或减少,从而得知脱氢酶的活性 丙酮酸 乳酸 ADH NAD 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应,可以偶联一 个适当的酶,以原初反应的产物作为偶联酶的底物,而偶联酶的产物可用分光光度法测定 322旋光测定法( polarimetry) 若底物和产物的旋光性不同,可通过测定反应混合物的旋光性(方向和大小)变化来测定酶 活性。 3.23荧光法( fluorescence) 氧化态的黄素( flavin)化合物发出强烈的荧光,还原态失去荧光。NAD和NADP无荧光, 而NADH和 NADPH有460nmn蓝色荧光。荧光法灵敏度高 324同位素测定法 用放射性同位素标记底物,酶反应后分离产物,测产物的放射性强度。此法灵敏度高,但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体,就易于分离 325电化学方法( electrochemistry) 32.51pH测定
2 高。 但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2 酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反 应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。 因此，必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的 5%以内的速度为初速度的 近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶 浓度密切相关。 3.2.1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸还原酶将 NO3－ 还原成 NO2－，NO2－ 与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应 生成玫瑰红色的偶氮化合物，在 520nm 处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以 NAD+或 NADP +为辅酶，NAD+或 NADP +在 340nm 处光吸收很少，而其还原形式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处光吸收较大，因此可以测定 340nm 处的光吸收变化来检 测 NADH 和 NADPH 的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一 个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。 3.2.2 旋光测定法（polarimetry） 若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶 活性。 3.2.3 荧光法（fluorescence） 氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和 NADP +无荧光， 而 NADH 和 NADPH 有 460nm 蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 3.2.4 同位素测定法（isotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。 3.2.5 电化学方法（electrochemistry） 3.2.5.1 pH 测定
对于某些酶促反应过程中会产生H或减少H的反应来说,用、 1000DH单位的pH计测定反 应液的pH变化,或为保持pH不变而加入酸或碱,记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.52电位测定 在一些酶促氧化还原反应中,底物和产物具有不同的氧化还原电位,可用由一恒定微电流极 化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.53电流测定 原理同上,以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.26化学反应法( chemical reaction) 酶促反应一段时间后,取出一部分反应液,用化学方法分析底物或产物的量。如ACC的测 定:加HgCl2终止反应,加 NaOcI-NaOH混合液使ACC转化成乙烯,再用气相色谱测乙烯。 3.3酶的分离纯化 33.1酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础,对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋 白质,所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性,利用它们的特殊 性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究,必须获得适量的酶。首先要选择适当的材 料,破碎细胞(酶存在于细胞外则不必破碎细胞)。若酶主要存在于某一细胞器中,应尽量分离 出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性,每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度, 算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低,说明该步骤不合适。酶纯化 般在低温条件下进行(0~4℃),但也有些酶有冷失活现象,如丙酮酸羧化酶在25℃下最稳定 低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温,但只要其没有冷失活现象,也应在低温下操作,这样 能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液(抽提液、萃取液、层析用液等)应该用缓冲液 pH应调到使酶最稳定的pH。若需要用到较酸或较碱的pH(如三氯乙酸沉淀),应尽量缩短时间 有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间,尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂,常用 的酶保护剂有巯基保护剂(巯基乙醇、谷胱甘肽GSH、二硫苏糖醇DII)、金属离子、EDIA、 辅酶等,有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。 用于酶纯化的方法主要有:分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等
3 对于某些酶促反应过程中会产生 H ＋或减少 H ＋的反应来说，用 1000 1 pH 单位的 pH 计测定反 应液的 pH 变化，或为保持 pH 不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.5.2 电位测定 在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极 化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.5.3 电流测定 原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.2.6 化学反应法（chemical reaction） 酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如 ACC 的测 定：加 HgCl2终止反应，加 NaOCl-NaOH 混合液使 ACC 转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。 3.3 酶的分离纯化 3.3.1 酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋 白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性，利用它们的特殊 性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。首先要选择适当的材 料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离 出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度， 算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。酶纯化 一般在低温条件下进行（0～4℃），但也有些酶有冷失活现象，如丙酮酸羧化酶在 25℃下最稳定， 低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温，但只要其没有冷失活现象，也应在低温下操作，这样 能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液（抽提液、萃取液、层析用液等）应该用缓冲液， pH 应调到使酶最稳定的 pH。若需要用到较酸或较碱的 pH（如三氯乙酸沉淀），应尽量缩短时间。 有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间，尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂，常用 的酶保护剂有巯基保护剂（巯基乙醇、谷胱甘肽 GSH、二硫苏糖醇 DTT）、金属离子、EDTA、 辅酶等，有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。 用于酶纯化的方法主要有：分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等
3.32材料的收集与处理 3.321原材料的选择 生物体中酶含量一般很低,应选择含酶量髙的材料作为原料。选择适当的物种、器官、组织、 细胞,甚至细胞器作为酶的来源,还应注意材料处于适当的发育阶段。必要时还可以采用人工处 理(环境条件、试剂处理〕来提高酶的含量。材料来源应尽量方便、价廉,动物主要是选择器官 和组织(如兔肌、牛心等),植物要选择器官和发育阶段(如黄化幼苗、绿叶等),微生物要选择 菌株(还可以通过诱变来提高酶的含量)。 要注意,不同来源的同一种酶,其结构和性质可能会有差异。 3322细胞的破碎 动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆,研磨前可用低温预冷或液氮速冻。大量组织 可用高速组织捣碎机。将组织制成丙酮粉,具有含水量低,脱脂,比较稳定等优点,往组织匀浆 中加入-15~-20℃的冷丙酮,抽滤,再加几次丙酮并抽滤,沉淀部分在室温下放置1小时左右 至无丙酮味,然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥,干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中 保存备用。丙酮粉中的脂肪已被除去,可以避免脂质的干扰,并使原来不溶的酶(膜结合酶)溶 于水。从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌,过滤或离心即可 对于微生物细胞的破碎,可采用碱处理、溶菌酶加EDIA处理、渗透冲击、超声波破碎、固 体剪切、液体剪切等方法。 3.323酶的抽提 在破碎细胞时应加入抽提液。抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂(如苯甲磺酰氟PMSF) EDIA、巯基保护剂、甘油、Mg2等组成。若抽提的酶是膜结合酶,抽提液中还应含有非离子型 的表面活性剂( Triton x-100、 Tween20、 Tween80等)。 333酶的初步纯化 酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开,使目标酶的纯度提高。酶的纯度用比活性来衡 量,以电泳结果为单带,且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。 3.33.1沉淀法 1.盐析法 不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同,在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐,在不同
4 3.3.2 材料的收集与处理 3.3.2.1 原材料的选择 生物体中酶含量一般很低，应选择含酶量高的材料作为原料。选择适当的物种、器官、组织、 细胞，甚至细胞器作为酶的来源，还应注意材料处于适当的发育阶段。必要时还可以采用人工处 理（环境条件、试剂处理）来提高酶的含量。材料来源应尽量方便、价廉，动物主要是选择器官 和组织（如兔肌、牛心等），植物要选择器官和发育阶段（如黄化幼苗、绿叶等），微生物要选择 菌株（还可以通过诱变来提高酶的含量）。 要注意，不同来源的同一种酶，其结构和性质可能会有差异。 3.3.2.2 细胞的破碎 动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆，研磨前可用低温预冷或液氮速冻。大量组织 可用高速组织捣碎机。将组织制成丙酮粉，具有含水量低，脱脂，比较稳定等优点，往组织匀浆 中加入－15～－20℃的冷丙酮，抽滤，再加几次丙酮并抽滤，沉淀部分在室温下放置 1 小时左右 至无丙酮味，然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥，干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中 保存备用。丙酮粉中的脂肪已被除去，可以避免脂质的干扰，并使原来不溶的酶（膜结合酶）溶 于水。从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌，过滤或离心即可。 对于微生物细胞的破碎，可采用碱处理、溶菌酶加 EDTA 处理、渗透冲击、超声波破碎、固 体剪切、液体剪切等方法。 3.3.2.3 酶的抽提 在破碎细胞时应加入抽提液。抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂（如苯甲磺酰氟 PMSF）、 EDTA、巯基保护剂、甘油、Mg 2＋等组成。若抽提的酶是膜结合酶，抽提液中还应含有非离子型 的表面活性剂（Triton x-100、Tween 20、Tween 80 等）。 3.3.3 酶的初步纯化 酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开，使目标酶的纯度提高。酶的纯度用比活性来衡 量，以电泳结果为单带，且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。 3.3.3.1 沉淀法 1．盐析法 不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同，在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐，在不同
的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来,离心可获得不同的蛋白质沉淀组分,这叫分级沉淀。常用 的盐是硫酸铵,因为它在低温下溶解度高,对大多数酶无毒,价廉,有时对酶还有稳定作用 2.有机溶剂沉淀 常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮。不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下 沉淀出来。 3.三氯乙酸沉淀 尽快恢复到中性pHl 4.PEG沉淀 聚乙二醇对蛋白质有保护作用,用PEG分级沉淀纯化效果很好。PEG2000、4000、6000、 8000都可以用(平均分子量)。 沉淀法要注意酶溶液的pH、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。沉淀法还能起到浓缩的 作用。 对于耐热的酶还可以采用热变性的方法,高温下短时间处理,许多不耐热的蛋白质发生沉淀, 离心后耐热的目标酶保留在上清液中。 3.332透析与超滤 1.透析 将酶液装进透析袋中,置于适当的缓冲液中,在低温下搅拌,更换几次透析液,可除去酶液 中高浓度的盐及一些小分子杂质,也能起到换缓冲液的作用 在装有酶液的透析袋外加固体 Sephadex或PEG吸水,可浓缩酶液 2.超滤 超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术,他是利用不同孔径的超滤膜,截留下不同分子量的 蛋白质,从而使分子量不同的蛋白质分离开,从而达到浓缩和纯化的目的 超滤的方式有真空吸滤和离心超滤两种 蛋白质的超滤特性是可变的,这取决于许多因素。 Westmacott(1972)研究了大肠杆菌部分 纯化的青霉素酶制剂的超滤特性,他使用一种截留分子量30,000的各向异性膜,缓冲液的pH和 盐浓度不同,酶的通透量变化在16%到59%之间;最高通透量在pH51~62,接近酶的等电点; 在pH80时,把缓冲液的浓度从1mmoL提高到30 mmo/L,酶的通透量从16%增加到20%;加
5 的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来，离心可获得不同的蛋白质沉淀组分，这叫分级沉淀。常用 的盐是硫酸铵，因为它在低温下溶解度高，对大多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。 2．有机溶剂沉淀 常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮。不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下 沉淀出来。 3．三氯乙酸沉淀 尽快恢复到中性 pH。 4．PEG 沉淀 聚乙二醇对蛋白质有保护作用，用 PEG 分级沉淀纯化效果很好。PEG2000、4000、6000、 8000 都可以用（平均分子量）。 沉淀法要注意酶溶液的 pH、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。沉淀法还能起到浓缩的 作用。 对于耐热的酶还可以采用热变性的方法，高温下短时间处理，许多不耐热的蛋白质发生沉淀， 离心后耐热的目标酶保留在上清液中。 3.3.3.2 透析与超滤 1．透析 将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去酶液 中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。 在装有酶液的透析袋外加固体 Sephadex 或 PEG 吸水，可浓缩酶液。 2．超滤 超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术，他是利用不同孔径的超滤膜，截留下不同分子量的 蛋白质，从而使分子量不同的蛋白质分离开，从而达到浓缩和纯化的目的。 超滤的方式有真空吸滤和离心超滤两种。 蛋白质的超滤特性是可变的，这取决于许多因素。Westmacott（1972）研究了大肠杆菌部分 纯化的青霉素酶制剂的超滤特性，他使用一种截留分子量 30,000 的各向异性膜，缓冲液的 pH 和 盐浓度不同，酶的通透量变化在 1.6%到 55%之间；最高通透量在 pH5.1～6.2，接近酶的等电点； 在 pH8.0 时，把缓冲液的浓度从 1mmol/L 提高到 30mmol/L，酶的通透量从 1.6%增加到 20%；加