b.底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用 对化学修饰实验得出的结论应非常慎重,因为可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近, 由于空间位阻使得底物无法进入活性中心,从而表现出酶失去活性。活性中心往往有多个与底物 结合的基团,修饰其中的一个往往不能使酶失去活性,可能导致结合力减弱,也可能改变被结合 底物的专一性。被修饰的氨基酸残基的位号可通过肽链的部分消化分析得到 422动力学分析法 动力学分析法是利用改变酶反应介质的pH,观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含 有许多可解离的基团,p改变必然会影响这些基团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离 状态发生变化时,会直接影响到酶的催化能力。因此,通过pH~酶催化活性关系的研究,可能 得到与催化直接相关的某些基团的pK值,进而推断这些基团的种类 pK值的测定以后再述 各基团的pK值有一理论值,但由于微环境的影响,实测的pk值往往与理论值有偏差,导 致分析基团种类的困难,这时需要用其他方法辅助分析,如测该基团的解离热函△H,或加有机 溶剂,改变溶液的电导率,作pH依存关系实验,从pK的变化来协助推断基团种类。 表、各种氨基酸残基的pK值与解离热函△H 氨基酸残基 值 △H(J/mol) a一羧基 3.0~3.2 ±6.276 β一羧基(天冬氨酸) 3.0~4.2 ±6.276 Y一羧基(谷氨酸) ~4.4 ±6.276 酚羟基(酪氨酸) 9.8~10.4 ±25,104 SH基(半胱氨酸) 8.3~8.6 咪唑基(组氨酸) 5.6~7.0 28.870~31.380 氨基 7.6~8.4 41,840~54,392 a一氨基(胱氨酸) 6.5~8.5 ε一氨基(赖氨酸) 9.4~10.6 41,840~50,208 胍基(精氨酸) 116~12.6 50,208~54,392
6 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。 对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近， 由于空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出酶失去活性。活性中心往往有多个与底物 结合的基团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能导致结合力减弱，也可能改变被结合 底物的专一性。被修饰的氨基酸残基的位号可通过肽链的部分消化分析得到。 4.2.2 动力学分析法 动力学分析法是利用改变酶反应介质的 pH，观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含 有许多可解离的基团，pH 改变必然会影响这些基团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离 状态发生变化时，会直接影响到酶的催化能力。因此，通过 pH～酶催化活性关系的研究，可能 得到与催化直接相关的某些基团的 pK 值，进而推断这些基团的种类。 pK 值的测定以后再述。 各基团的 pK 值有一理论值，但由于微环境的影响，实测的 pK 值往往与理论值有偏差，导 致分析基团种类的困难，这时需要用其他方法辅助分析，如测该基团的解离热函△H，或加有机 溶剂，改变溶液的电导率，作 pH 依存关系实验，从 pK 的变化来协助推断基团种类。 表、各种氨基酸残基的 pK 值与解离热函△H 氨基酸残基 pK 值 △H（J/mol） α－羧基 3.0 ~ 3.2 ±6,276 β－羧基（天冬氨酸） 3.0 ~ 4.2 ±6,276 γ－羧基（谷氨酸） ~ 4.4 ±6,276 酚羟基（酪氨酸） 9.8 ~ 10.4 ±25,104 SH 基（半胱氨酸） 8.3 ~ 8.6 — 咪唑基（组氨酸） 5.6 ~ 7.0 28,870 ~ 31,380 α－氨基 7.6 ~ 8.4 41,840 ~ 54,392 α－氨基（胱氨酸） 6.5 ~ 8.5 — ε－氨基（赖氨酸） 9.4 ~ 10.6 41,840 ~ 50,208 胍基（精氨酸） 11.6 ~ 12.6 50,208 ~ 54,392
42.3x-光衍射分析法 通过多种方法相互印证,可得出正确的结论 43组成酶活性中心的重要化学基团 酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高,它们是Ser、Hs、Cys、Iyr、Asp、Glu、Ly 同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性中心含有丝氨酸残 基,称为丝氨酸蛋白酶;胃蛋白酶和木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸残基,称为半胱氨酸蛋白 酶。在脱氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以为未知活性中心基团的酶的研究提供 线索。 同位素标记活性中心基团后,用蛋白酶部分水解,得到同位素标记的肽段,分析其氨基酸顺 序,可以了解活性中心附近的氨基酸顺序 实验表明,同类酶不仅有相同的活性中心基团,而且附近的氨基酸顺序也很相似 表、一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 胰蛋白酶(牛) .Asp-Ser-Cys-GIn-Gly-Asp-"Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys 胰凝乳蛋白酶(牛)… Ser-Ser-Cys-Met-Gly- Asp-"Ser-Gly-Gly- Pro-Leu- Val-Cys-Lys-Lys-Asn… 弹性蛋白酶(猪)|… Ser-Gly- CvS-Gln-Gly-Asp- Ser-Gly-Gly-Pro-leu- His-Cys-Leu-al-Asin 凝血酶(牛) Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-"Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser- Pro 蛋白酶( S. griseus)|…… hr-Cys-Glu-Gly-Asp-* Ser-Gly- Gly-Pro- Met-Phe 表示有催化活性的丝氨酸残基 表、一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 木瓜蛋白酶…Pro-l- LyS-Asn- Glu-GIv- Ser-CyS-Gly-Ser" Cys-Trp… 无花果蛋白酶…o- lle-Arg-Gln- Glu-GIy- GIn-CyS-Gly-Ser-+ Cys-Trp 菠萝蛋白酶 Asn-GIn-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala- Cys-Trp *表示有催化活性的半胱氨酸残基
7 4.2.3 x-光衍射分析法 通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。 4.3 组成酶活性中心的重要化学基团 酶活性中心有 7 种氨基酸残基参加的频率最高，它们是 Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性中心含有丝氨酸残 基，称为丝氨酸蛋白酶；胃蛋白酶和木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸残基，称为半胱氨酸蛋白 酶。在脱氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以为未知活性中心基团的酶的研究提供 线索。 同位素标记活性中心基团后，用蛋白酶部分水解，得到同位素标记的肽段，分析其氨基酸顺 序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。 实验表明，同类酶不仅有相同的活性中心基团，而且附近的氨基酸顺序也很相似。 表、一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 胰蛋白酶（牛） …Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys… 胰凝乳蛋白酶（牛） …Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn… 弹性蛋白酶（猪） …Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn… 凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro… 蛋白酶（S. griseus） ………Thr-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Met-Phe…… *表示有催化活性的丝氨酸残基 表、一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 木瓜蛋白酶 …Pro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp… 无花果蛋白酶 …Pro-Ile-Arg-Gln-Glu-Gly-Gln-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp… 菠萝蛋白酶 …Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-*Cys-Trp… *表示有催化活性的半胱氨酸残基