亲和标记法 能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很 少,并且专一性差,经常出现也修饰活性部位 之外的残基的情况。为了解决此问题,人们合 成了一些底物类似物,其上带有高反应性基团, 它们特异地与相应的酶的活性部位结合,然后 与活性部位的残基反应,这样就大大提高了修 饰的专一性,这种方法叫亲和标记法
亲和标记法 能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很 少，并且专一性差，经常出现也修饰活性部位 之外的残基的情况。为了解决此问题，人们合 成了一些底物类似物，其上带有高反应性基团， 它们特异地与相应的酶的活性部位结合，然后 与活性部位的残基反应，这样就大大提高了修 饰的专一性，这种方法叫亲和标记法
TPCK对胰凝乳蛋白酶 的亲和标记 最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶 的亲和标记物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮 (TPCK),胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯 磺酰-L-苯丙氨酸乙酯(TPE)。当将TPDK与 胰凝乳蛋白酶一起保温后,酶失去活性,氨基 酸分析表明,TPDK修饰了His57。TPCK不与 胰凝乳蛋白酶原、变性的胰凝乳蛋白酶、DIP 胰凝乳蛋白酶反应。这些证据说明His57是组成 酶活性部位的残基之一
TPCK对胰凝乳蛋白酶 的亲和标记 最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶 的亲和标记物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮 （TPCK），胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯 磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）。当将TPDK与 胰凝乳蛋白酶一起保温后，酶失去活性，氨基 酸分析表明，TPDK修饰了His57。TPCK不与 胰凝乳蛋白酶原、变性的胰凝乳蛋白酶、DIP- 胰凝乳蛋白酶反应。这些证据说明His57是组成 酶活性部位的残基之一
TPE和TPCK的结构 CH2-CH--COOCH2 CH3 CH2—CH—C—CH2C1 NH NH SO. CH3 CH3 对甲苯磺酰一L-苯丙氨酸乙酯 对甲苯磺酰一L-苯丙氨酰氯甲基酮 (TPE) (TPCK) H N R一C—C N /HCI R一C—CH2Cl+ N Hi TPCK E-Hiss7 烷化(失活)
TPE和TPCK的结构
动力学参数测定法 在不同pH下测定酶活力,可以得到与酶 活力直接相关的可解离基团的pKa值,从而推 测出是些什么残基
动力学参数测定法 在不同pH下测定酶活力，可以得到与酶 活力直接相关的可解离基团的pKa值，从而推 测出是些什么残基
Ⅹ射线晶体结构分析法 使底物与酶结合,制成晶体,再进行X光 晶体衍射分析,可得到底物附近有哪些残基
X射线晶体结构分析法 使底物与酶结合，制成晶体，再进行X光 晶体衍射分析，可得到底物附近有哪些残基