隆目的基因组片断等方面的研究。 DNA的分离纯化技术是建立在其结构性质的基础之上的，DNA的一级结构就是指四种 脱氧核苷酸的组成和排列顺序，主要由3,5硫酸二酯键维持。生物遗传信息就编码贮存于 其一级结构之中，同时一级结构也决定其高级结构形式，所以为了保证DNA结构功能的研 究，完整的一级结构是最基本的要求，这也是核酸分离纯化的一个总的原则。物理、化学等 多种因素均可导致对其一级结构的破坏，这在分离纯化过程中均应尽力避免。真核基因组 DA的分子量大，在分离纯化尤其要注意对其一级结构的保护。在真核细胞内，DNA与组 蛋白盘绕形成核小体，并进一步折叠包装压缩为染色体。因此，在DNA分离纯化时，首先 还要将核蛋白做解聚处理，以释放出DNA。另外，进行DNA分离纯化时还必须排除蛋白 质、RNA等其它分子的污染，保证DNA制品的纯度，以满足后续实验的要求。 因此，尽管DNA分离纯化的方法有很多，但根据上述原则，分离纯化的步骤基本一致， 无外乎破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类、RNA等生物大分子，沉淀 DNA,去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化DNA等。不同的分离纯化方法分别具有不同的特 点及适用范围，因此，在实际应用中，应根据具体生物材料和研究目的对核酸完整性、纯度、 产量的要求而选择不同的方法。 常用的真核细胞基因组DNA分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒 绷绕法等。 酚抽提法的原理主要在于通过用蛋白酶K、SDS、RNA酶消化裂解细胞和解聚核蛋白 后，再通过交替使用酚和氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以达到有效去除蛋白质的作用。 实际操作中常常依次使用饱和酚、酚/氯仿和氯仿三种溶液来去除蛋白质，最后在在高盐存 在下用乙醇沉淀收集DNA。通过酚抽提法可以得到1OO一20Okb左右的基因组DNA片段， 经适当剪切后，适用于基因组文库的构建。该法也是目前真核基因组DNA分离提取的普道 使用和经济实用的方法。在本实验中，我们即主要采用酚抽提来进行基因组DA的分离纯 化。 甲酰胺解聚法则主要利用了甲酰胺的特殊化学性质。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可裂 解DNA与蛋白质的复合物，又可变性沉淀释放的蛋白质，但对蛋白酶K的活性无显著影响。 该方法裂解细胞和消化蛋白质的步骤与酚抽提法相同，但不进行酚抽提，而是利用高浓度甲 酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后使用火棉胶袋进行充分透析处理DNA样品。由于提 取过程操作步骤少，DNA分子量一般可达到200kb,经适当处理后，适用于高包装容量载 体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段DNA
隆目的基因组片断等方面的研究。 DNA 的分离纯化技术是建立在其结构性质的基础之上的，DNA 的一级结构就是指四种 脱氧核苷酸的组成和排列顺序，主要由 3',5'-磷酸二酯键维持。生物遗传信息就编码贮存于 其一级结构之中，同时一级结构也决定其高级结构形式，所以为了保证 DNA 结构功能的研 究，完整的一级结构是最基本的要求，这也是核酸分离纯化的一个总的原则。物理、化学等 多种因素均可导致对其一级结构的破坏，这在分离纯化过程中均应尽力避免。真核基因组 DNA 的分子量大，在分离纯化尤其要注意对其一级结构的保护。在真核细胞内，DNA 与组 蛋白盘绕形成核小体，并进一步折叠包装压缩为染色体。因此，在 DNA 分离纯化时，首先 还要将核蛋白做解聚处理，以释放出 DNA。另外，进行 DNA 分离纯化时还必须排除蛋白 质、RNA 等其它分子的污染，保证 DNA 制品的纯度，以满足后续实验的要求。 因此，尽管 DNA 分离纯化的方法有很多，但根据上述原则，分离纯化的步骤基本一致， 无外乎破碎细胞，去除与 DNA 结合的蛋白质以及多糖、脂类、RNA 等生物大分子，沉淀 DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化 DNA 等。不同的分离纯化方法分别具有不同的特 点及适用范围，因此，在实际应用中，应根据具体生物材料和研究目的对核酸完整性、纯度、 产量的要求而选择不同的方法。 常用的真核细胞基因组 DNA 分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒 缠绕法等。 酚抽提法的原理主要在于通过用蛋白酶 K、SDS、RNA 酶消化裂解细胞和解聚核蛋白 后，再通过交替使用酚和氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以达到有效去除蛋白质的作用。 实际操作中常常依次使用饱和酚、酚/氯仿和氯仿三种溶液来去除蛋白质，最后在在高盐存 在下用乙醇沉淀收集 DNA。通过酚抽提法可以得到 100～200kb 左右的基因组 DNA 片段， 经适当剪切后，适用于基因组文库的构建。该法也是目前真核基因组 DNA 分离提取的普遍 使用和经济实用的方法。在本实验中，我们即主要采用酚抽提来进行基因组 DNA 的分离纯 化。 甲酰胺解聚法则主要利用了甲酰胺的特殊化学性质。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可裂 解 DNA 与蛋白质的复合物，又可变性沉淀释放的蛋白质，但对蛋白酶 K 的活性无显著影响。 该方法裂解细胞和消化蛋白质的步骤与酚抽提法相同，但不进行酚抽提，而是利用高浓度甲 酰胺解聚蛋白质与 DNA 的结合，然后使用火棉胶袋进行充分透析处理 DNA 样品。由于提 取过程操作步骤少，DNA 分子量一般可达到 200kb，经适当处理后，适用于高包装容量载 体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段 DNA
玻棒缠绕法主要利用了真核基因组分子量大的特点，该方法将基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面上，然后将沉淀的大分子基因组DNA缠绕到一个Shepherd钩上。本 法提取的DNA分子约为8Okb,不适合于构建基因组文库，但适用于用于Southern杂交和 PCR反应。 另外，近年来世界各大生物技术商业公司也纷纷投入巨资开发新的更为简便的商业化基 因组DNA分离纯化试剂盒，从而使基因组DNA的分离纯化更为方便、快捷、高效和自动 化。如Promega、QIAGEN、Invitrogene等公司均有种类繁多的基因组DNA分离纯化试剂 盒，研究人员可以根据自己的经济实力和研究目的去选择合适的试剂盒 基因组DNA分离纯化完成后，还需要对得到的DNA样品进行DNA浓度检测、纯度鉴 定和完整性检测。只有在通过这些检测分析确认得到高质量的DNA样品后，方可进行下一 步的后续实验研究。 DNA浓度的测定一般使用紫外分光光度计来进行检测。核酸分子中的碱基具有共轭双 键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。在波长260m紫外线下，1OD值 的光密度相当于双链DNA浓度为50ugml:单链DNA为40gml,可以此来计算核酸样 品的浓度。另外，因为蛋白质的最大吸收波长为280m,所以在用紫外分光光度计对DNA 浓度进行测定时，还可以同时检测280m处的光密度值，通过计算A260/A280比值来推断 DNA的纯度。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值约为1.8，比值升高提示有RNA 的污染，而比值降低则提示有蛋白质的污染。 基因组DNA完整性则主要通过琼脂糖凝胶电泳来进行检测。基因组DNA片段的分子 量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图谱中的基因组DNA条带则呈拖尾状。 【实验材料】 1.仪器： 恒温水浴箱，台式冷冻高速离心机，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，50m离心管， 1,5 ml Eppendorf管，剪刀，牙签，宽口移液管(5ml、10ml),移液器，吸头，锥形瓶，微 波炉，简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等。 2.试剂： (1)磷酸盐缓冲液(PBS):NaC18g,KC10.2g,NazHPO,1.44g,KHPO40.24g, 800ml蒸馏水溶解，用HC1调节pH至7.4，加水定容至1L,高压蒸气灭南20min,保存 于室温。 (2)DNA提取缓冲液：10mmol/LTis.C1(pH8.0),0.1 mol/L EDTA(pH8.0),20gml
玻棒缠绕法主要利用了真核基因组分子量大的特点，该方法将基因组 DNA 沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面上，然后将沉淀的大分子基因组 DNA 缠绕到一个 Shepherd 钩上。本 法提取的 DNA 分子约为 80kb，不适合于构建基因组文库，但适用于用于 Southern 杂交和 PCR 反应。 另外，近年来世界各大生物技术商业公司也纷纷投入巨资开发新的更为简便的商业化基 因组 DNA 分离纯化试剂盒，从而使基因组 DNA 的分离纯化更为方便、快捷、高效和自动 化。如 Promega、QIAGEN、Invitrogene 等公司均有种类繁多的基因组 DNA 分离纯化试剂 盒，研究人员可以根据自己的经济实力和研究目的去选择合适的试剂盒。 基因组 DNA 分离纯化完成后，还需要对得到的 DNA 样品进行 DNA 浓度检测、纯度鉴 定和完整性检测。只有在通过这些检测分析确认得到高质量的 DNA 样品后，方可进行下一 步的后续实验研究。 DNA 浓度的测定一般使用紫外分光光度计来进行检测。核酸分子中的碱基具有共轭双 键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为 260 nm。在波长 260 nm 紫外线下，1OD 值 的光密度相当于双链 DNA 浓度为 50 µg/ml；单链 DNA 为 40 µg/ml，可以此来计算核酸样 品的浓度。另外，因为蛋白质的最大吸收波长为 280 nm，所以在用紫外分光光度计对 DNA 浓度进行测定时，还可以同时检测 280 nm 处的光密度值，通过计算 A260/A280 比值来推断 DNA 的纯度。在 TE 缓冲液中，纯 DNA 的 A260/A280 比值约为 1.8，比值升高提示有 RNA 的污染，而比值降低则提示有蛋白质的污染。 基因组 DNA 完整性则主要通过琼脂糖凝胶电泳来进行检测。基因组 DNA 片段的分子 量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图谱中的基因组 DNA 条带则呈拖尾状。 【实验材料】 1． 仪器： 恒温水浴箱，台式冷冻高速离心机，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，50 ml 离心管， 1.5 ml Eppendorf 管，剪刀，牙签，宽口移液管（5 ml、10 ml），移液器，吸头，锥形瓶，微 波炉，简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等。 2． 试剂： （1） 磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g， 800 ml 蒸馏水溶解，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1 L，高压蒸气灭菌 20 min，保存 于室温。 （2） DNA 提取缓冲液：10 mmol/L Tis.Cl（pH8.0），0.1 mol/L EDTA（pH8.0），20 μg/ml
胰RNase,.O.5%SDS。前三种成分可预先混合并于室温保存，RNa在用前加入 (3)苯酚：熏蒸后，用0.5 mol/LTis-Cl(pH8.0)平衡。 (4)TE缓冲液(pH8.0):10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0). (5)酸性柠檬酸葡萄糖(acid-tra-dextrose,ACD)抗凝剂：柠檬酸0.48g,柠檬 酸钠1.32g,右旋箱萄糖1.47g,加水至100ml溶解。使用时，每6ml血液加入1 mlACD 抗凝剂。 (6)5×TBE电泳缓冲液：54 g Tris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0), 800ml蒸馏水溶解，加水定容至1L。 (7)其他试剂：蛋白酶K(20mgml),溴化乙锭溶液，氯仿，异戊醇，琼脂糖，95% 乙醇，75%乙醇，1kb梯度DNA分子量参照物，加样缓冲液，3molL乙酸钠等。 (8)组织和细胞：贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织或血样。 【实验步骤】 (一)DNA的提取（酚/氯仿抽提法） 1.样品的预处理： (I)细胞样本：用培养细胞提取基因组DNA时，应尽可能收集生长状态良好的正在 培养的细胞即行抽提，不能及时提取时，则须将细胞放于液氯或一80℃冰箱保存。对于悬浮 培养细胞，经10O0g离心5min收集细胞，然后加入DNA提取液混悬细胞沉淀，37℃水浴 1h温有。对于贴壁培养细胞，则需倒出培养皿中的培养液，用预冷的PBS洗2次，将DNA 提取液直接加入培养皿中，晃动培养皿至液体变粘稠，然后将其移入离心管，37℃水浴h 温有。DNA提取液的使用量为5×10个细胞/ml。 (2)组织样本：取1g新鲜组织，液氮中速冻，用锡箔纸包裹，在用液氮预冷的研钵 中迅速将组织磨碎。液氨挥发后，将组织粉末一点点地加入含1 0 ml DNA提取液的离心管 中，晃动均匀，37C水浴温有1h。 (3)血液样本：收集10ml新鲜血液于含ACD抗凝剂的离心管中，1300g4℃离心 15mn,吸去上清，小心吸取淡黄色层，移至一新的离心管中并再次离心，弃去红细胞沉淀。 用7 ml DNA提取液悬浮细胞，37C水浴温有1h。对于冻存血液，在解冻后加入等体积PBS 混匀，室温3500g离心15mi,弃去含有裂解红细胞的上清，用7 ml DNA提取液悬浮细胞， 37℃水浴温育1h。 2.消化：加入蛋白酶K至终浓度100ugml~300gml,上下颠倒离心管混匀，使溶 液至粘稠状。50℃水浴保3，以裂解细胞、消化蛋白，其间应不时轻轻上下颠倒离心管混
胰 RNase，0.5％SDS。前三种成分可预先混合并于室温保存，RNase 在用前加入。 （3） 苯酚：熏蒸后，用 0.5 mol/L Tis•Cl（pH8.0）平衡。 （4） TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris•Cl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 （5） 酸性柠檬酸葡萄糖（acid-citrate-dextrose，ACD）抗凝剂：柠檬酸 0.48 g，柠檬 酸钠 1.32 g，右旋葡萄糖 1.47 g，加水至 100 ml 溶解。使用时，每 6 ml 血液加入 1 ml ACD 抗凝剂。 （6） 5×TBE 电泳缓冲液：54 g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）， 800 ml 蒸馏水溶解，加水定容至 1 L。 （7） 其他试剂：蛋白酶 K（20 mg/ml），溴化乙锭溶液，氯仿，异戊醇，琼脂糖，95％ 乙醇，75％乙醇，1kb 梯度 DNA 分子量参照物，加样缓冲液，3 mol/L 乙酸钠等。 （8） 组织和细胞：贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织或血样。 【实验步骤】 （一）DNA 的提取（酚/氯仿抽提法） 1． 样品的预处理： （1） 细胞样本：用培养细胞提取基因组 DNA 时，应尽可能收集生长状态良好的正在 培养的细胞即行抽提，不能及时提取时，则须将细胞放于液氮或－80℃冰箱保存。对于悬浮 培养细胞，经 1000 g 离心 5 min 收集细胞，然后加入 DNA 提取液混悬细胞沉淀，37℃水浴 1 h 温育。对于贴壁培养细胞，则需倒出培养皿中的培养液，用预冷的 PBS 洗 2 次，将 DNA 提取液直接加入培养皿中，晃动培养皿至液体变粘稠，然后将其移入离心管，37℃水浴 1h 温育。DNA 提取液的使用量为 5×106 个细胞/ml。 （2） 组织样本：取 1 g 新鲜组织，液氮中速冻，用锡箔纸包裹，在用液氮预冷的研钵 中迅速将组织磨碎。液氮挥发后，将组织粉末一点点地加入含 10 ml DNA 提取液的离心管 中，晃动均匀，37℃水浴温育 1 h。 （3） 血液样本：收集 10 ml 新鲜血液于含 ACD 抗凝剂的离心管中，1300 g 4℃离心 15 min，吸去上清，小心吸取淡黄色层，移至一新的离心管中并再次离心，弃去红细胞沉淀。 用 7 ml DNA 提取液悬浮细胞，37℃水浴温育 1h。对于冻存血液，在解冻后加入等体积 PBS 混匀，室温 3500 g 离心 15 min，弃去含有裂解红细胞的上清，用 7 ml DNA 提取液悬浮细胞， 37℃水浴温育 1 h。 2． 消化：加入蛋白酶 K 至终浓度 100 µg/ml～300 µg/ml，上下颠倒离心管混匀，使溶 液至粘稠状。50℃水浴保 3 h，以裂解细胞、消化蛋白，其间应不时轻轻上下颠倒离心管混
匀粘稠的溶液，以使消化充分。 3.酚/氯仿抽提纯化DNA:将上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚，轻轻 地上下颠倒离心管5min~10min,直至水相与酚相混匀呈乳浊状。室温5000g离心15mim, 小心地用宽口吸管将粘稠的水相转移至另一新离心管中。加入等体积的酚/氯仿异戊醇 (25:24:1),轻轻颠倒混匀，室温5000g离心15min,用宽口吸管小心地吸取上层水相，转 移至另一新离心管中。再用等体积的氯仿抽提一次。 4.沉淀DNA:加入1/I0体积的3moL乙酸钠和2倍体积室温或预冷的无水乙醇， 轻轻顿倒混匀离心管，即可观察到乳白色云絮状DNA的出现。用牙签小心挑取絮状DNA, 转移至一新的离心管中。如果DNA沉淀为碎片，则在室温5OO0g离心5min收集DNA沉 5.洗涤DNA:加入75%乙醇1ml,5000g离心5min,小心弃去上清。将离心管倒置 于滤纸上空干，室温或真空干燥以使残留的乙醇挥发。但注意不要使DNA完全干燥，否则 难以融解。 6.DNA样品的溶解：加入适量TE溶解DNA样品，可过夜放置以使DNA完全溶解， 4度保存备用。 (二)DNA的浓度及纯度检测 取适量DA样品，用TE进行稀释，正溶液作为空白对照，在紫外分光光度计上测定 A0和A2o值，并计算AooA:m比值。按照下面公式计算DNA样品的浓度 DNA浓度(ugl)=A0×50X稀释倍数10O0 经上述方法制备的DNA样品，A26O/As0比值应在1.7~20之间。如比值过高提示有RNA 的污染，而比值过低则提示蛋白质没有得到有效去除。 (三)DNA的琼脂精凝胶电泳检测 1.凝胶制备：称取0.8g琼脂糖于维形瓶中，加入100ml1×TBE电泳缓冲液。微波 炉加热使琼脂糖完全溶解。同时准备凝胶模具并插上梳子。待胶液冷却至60℃左右后，将 琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中，避免气泡产生，若有气泡产生可用移液器吸头移去。 凝胶厚度一般为0,3cm~-0.5cm。室温下静置20mim~30min左右，待琼脂糖胶液完全凝固。 胶凝之后，轻轻移去梳子，凝胶置于1×TBE电泳缓冲液中备用。 2.上样：将凝胶置于胶板模具上，放在电泳槽内，注入适量的1×TBE电泳缓冲液， 液面应高于胶面5mm左右。取适量的DNA样品与加样缓冲液混合，然后用微量移液器将 DNA样品加入加样孔中，同时加入Ikb梯度DNA分子量参照物
匀粘稠的溶液，以使消化充分。 3． 酚/氯仿抽提纯化 DNA：将上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚，轻轻 地上下颠倒离心管 5 min～10 min，直至水相与酚相混匀呈乳浊状。室温 5000 g 离心 15 min， 小心地用宽口吸管将粘稠的水相转移至另一新离心管中。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇 （25:24:1），轻轻颠倒混匀，室温 5000 g 离心 15 min，用宽口吸管小心地吸取上层水相，转 移至另一新离心管中。再用等体积的氯仿抽提一次。 4． 沉淀 DNA：加入 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2 倍体积室温或预冷的无水乙醇， 轻轻颠倒混匀离心管，即可观察到乳白色云絮状 DNA 的出现。用牙签小心挑取絮状 DNA， 转移至一新的离心管中。如果 DNA 沉淀为碎片，则在室温 5000 g 离心 5 min 收集 DNA 沉 淀。 5． 洗涤 DNA：加入 75％乙醇 1 ml，5000 g 离心 5 min，小心弃去上清。将离心管倒置 于滤纸上空干，室温或真空干燥以使残留的乙醇挥发。但注意不要使 DNA 完全干燥，否则 难以融解。 6． DNA 样品的溶解：加入适量 TE 溶解 DNA 样品，可过夜放置以使 DNA 完全溶解。 4 度保存备用。 （二）DNA 的浓度及纯度检测 取适量 DNA 样品，用 TE 进行稀释，TE 溶液作为空白对照，在紫外分光光度计上测定 A260 和 A280 值，并计算 A260/A280 比值。按照下面公式计算 DNA 样品的浓度： DNA 浓度（µg/µl）=A260×50×稀释倍数/1000 经上述方法制备的 DNA 样品，A260/A280 比值应在 1.7～2.0 之间。如比值过高提示有 RNA 的污染，而比值过低则提示蛋白质没有得到有效去除。 （三）DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 1． 凝胶制备：称取 0.8 g 琼脂糖于锥形瓶中，加入 100 ml 1×TBE 电泳缓冲液。微波 炉加热使琼脂糖完全溶解。同时准备凝胶模具并插上梳子。待胶液冷却至 60℃左右后，将 琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中，避免气泡产生，若有气泡产生可用移液器吸头移去。 凝胶厚度一般为 0.3 cm～0.5 cm。室温下静置 20 min～30 min 左右，待琼脂糖胶液完全凝固。 胶凝之后，轻轻移去梳子，凝胶置于 1×TBE 电泳缓冲液中备用。 2． 上样：将凝胶置于胶板模具上，放在电泳槽内，注入适量的 1×TBE 电泳缓冲液， 液面应高于胶面 5 mm 左右。取适量的 DNA 样品与加样缓冲液混合，然后用微量移液器将 DNA 样品加入加样孔中，同时加入 1 kb 梯度 DNA 分子量参照物
3.电泳：加样完毕后，连接电泳槽与电源之间的电源线，正极为红色，负极为黑色 凝胶的加样端应置于负极。设置电压和时间，电压一般为80伏~100伏，时间一般约40mn~ S0mi。打开电源，若连接良好，负极附近的铂丝会有气泡产生。电泳时间的选择取决于胶 的长度和电压的大小，胶越长，电压越低，所需时间就越长，但电压过高时，会降低大分子 DA片断的分辨率。最终应根据上样缓冲液中指示剂溴酚蓝迁移的位置（溴酚蓝和500bp 大小DNA的迁移率相近)，判断是否终止电泳，切断电源。 4.染色与观察：电泳结束后，取出凝胶，放入EB染色液中染色5min一l0min。染色 后，用水冲洗凝胶，使用简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统观察凝胶电泳的结果并拍照记 录。注意和I灿梯度DNA分子量参照物对比，推测提取的DNA样品的分子量大小，并注 意观察DNA样品条带的强度、锐利程度和有无拖带等现象。 【注意事项】 1.液氨的使用：液氨操作时应戴保暖手套和防护目镜，以防溅出的液氨冻伤皮肤。 2.血液抗凝剂的选择：抗凝剂的种类很多，但用于提取DNA时，使用ACD抗凝剂抗 凝比用其它抗凝剂能更好地保存大分子DNA。经过抗凝处理的血液在DNA制备前可以在 一70℃长期保存，也可以在2C一8C放置数天至2个月，但DNA的产率会随放置时间的延 长而有所降低。 3.样本的预处理：对于组织细胞的破碎处理，也可以采用匀浆或者超声等物理破碎方 法，但这些方法会对大分子DNA有剪切作用。 4.蛋白酶K的使用：不同批次的蛋白酶K的活性有差异，因此在正式实验前应做预 实验确定合适的使用浓度。新购买的蛋白酶K应分装成小份于一20℃长期贮存，避免反复 陈融。 5.避免物理剪切作用对大分子DNA的损伤：基因组DNA分子量很大，易受剪切力作 用而发生断裂，所以在操作过程中应轻柔，提取步骤中的混匀操作，动作不可剧烈，应缓慢 的上下颠倒离心管进行混匀。移液器的吸头也应剪去前面的部分，以避免DNA溶液快速通 过狭长的通道而受损伤。 6.DNA的溶解：75%乙醇洗涤DNA后晾干时，注意不要让DNA沉淀完全干燥，香 则极难溶解。加入T正溶解DNA时，可置于4C过夜，或者置于旋转混合仪上缓慢旋转混 合以尽快完全溶解。 7.关于细胞样品的处理：用培养细胞提取基因组DNA时，应尽可能新鲜收集即行 提，不能及时提取时，必须将细胞放于液氮或一80℃中
3． 电泳：加样完毕后，连接电泳槽与电源之间的电源线，正极为红色，负极为黑色， 凝胶的加样端应置于负极。设置电压和时间，电压一般为 80 伏～100 伏，时间一般约 40 min～ 50 min。打开电源，若连接良好，负极附近的铂丝会有气泡产生。电泳时间的选择取决于胶 的长度和电压的大小，胶越长，电压越低，所需时间就越长，但电压过高时，会降低大分子 DNA 片断的分辨率。最终应根据上样缓冲液中指示剂溴酚蓝迁移的位置（溴酚蓝和 500 bp 大小 DNA 的迁移率相近），判断是否终止电泳，切断电源。 4． 染色与观察：电泳结束后，取出凝胶，放入 EB 染色液中染色 5 min～10 min。染色 后，用水冲洗凝胶，使用简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统观察凝胶电泳的结果并拍照记 录。注意和 1 kb 梯度 DNA 分子量参照物对比，推测提取的 DNA 样品的分子量大小，并注 意观察 DNA 样品条带的强度、锐利程度和有无拖带等现象。 【注意事项】 1． 液氮的使用：液氮操作时应戴保暖手套和防护目镜，以防溅出的液氮冻伤皮肤。 2． 血液抗凝剂的选择：抗凝剂的种类很多，但用于提取 DNA 时，使用 ACD 抗凝剂抗 凝比用其它抗凝剂能更好地保存大分子 DNA。经过抗凝处理的血液在 DNA 制备前可以在 －70℃长期保存，也可以在 2℃～8℃放置数天至 2 个月，但 DNA 的产率会随放置时间的延 长而有所降低。 3． 样本的预处理：对于组织细胞的破碎处理，也可以采用匀浆或者超声等物理破碎方 法，但这些方法会对大分子 DNA 有剪切作用。 4． 蛋白酶 K 的使用：不同批次的蛋白酶 K 的活性有差异，因此在正式实验前应做预 实验确定合适的使用浓度。新购买的蛋白酶 K 应分装成小份于－20℃长期贮存，避免反复 冻融。 5． 避免物理剪切作用对大分子 DNA 的损伤：基因组 DNA 分子量很大，易受剪切力作 用而发生断裂，所以在操作过程中应轻柔，提取步骤中的混匀操作，动作不可剧烈，应缓慢 的上下颠倒离心管进行混匀。移液器的吸头也应剪去前面的部分，以避免 DNA 溶液快速通 过狭长的通道而受损伤。 6． DNA 的溶解：75％乙醇洗涤 DNA 后晾干时，注意不要让 DNA 沉淀完全干燥，否 则极难溶解。加入 TE 溶解 DNA 时，可置于 4℃过夜，或者置于旋转混合仪上缓慢旋转混 合以尽快完全溶解。 7． 关于细胞样品的处理：用培养细胞提取基因组 DNA 时，应尽可能新鲜收集即行抽 提，不能及时提取时，必须将细胞放于液氮或－80℃中